- форма частиц;
- размер и распределение по размеру наночастиц;
- степень агрегированности наночастиц;
- характер распределения наночастиц в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений);
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степень агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, электронно-микроскопические изображения наночастиц и структуры нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений).
6.4.8. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в тонкой структуре природных биопленок
Природные биопленки в окружающей среде представляют собой органические образования на поверхности некоторых конструкционных элементов промышленных и жилых зданий, на поверхности сооружений из кирпича, камня, бетона, металла, керамики, дерева, пластмассы, а также на поверхности отдельных агрегатов и деталей технологических линий, машин и приборов, образовавшихся в процессе жизнедеятельности природных (диких) микробов или ассоциаций бактерий, дрожжей, грибов и одноклеточных водорослей. В структуре природных биопленок микробы ассимилируют или депонируют все то, что содержатся в воздухе, воде, почве: химические элементы, наночастицы, органические молекулы, продукты распада и разложения материалов и т.д.
Целью является определение наличия наночастиц в структуре природных биопленок, проведение структурной и морфометрической идентификация частиц в структуре биопленок и в живых микроорганизмах (бактериях, дрожжах, грибах и одноклеточных водорослях).
Образцы биопленки объемом 1-2 мм3 (10-15 кусочков) или биомассу в количестве 100-150 мг, собранную с поверхности конструкционных агрегатов или материалов, фиксируют и инактивируют 4,0 % раствором глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2).
Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в природных биопленках представлена в таблице 12.
Таблица 12
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в тонкой структуре природных биопленок
| Вид исследуемого материала | Биопленка или биомасса микроорганизмов, собранная с поверхности конструкционных материалов |
| Физическая форма исследуемого материала | Сухая или влажная биопленка (биомасса) |
| Количество материала для выполнения исследований | 100-150 мг сухой или влажной биомассы или 10-15 кусочков биопленки величиной 1-2 мм3 |
| Приборное обеспечение | Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4. |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100,0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода |
| репарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 4,0 % раствора глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление 2,0 % раствора четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией; – приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита); – заливочная эпоксидная смола; – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата; –приготовление раствора цитрата свинца; – приготовление эпоксидной смолы Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – биомассу бактерий фиксируют и инактивируют в 4,0 % растворе глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – бактерии дофиксируют в 2,0 % растворе четырехокиси осмия на ацетат-вероналовом буфере (по Ритер, Келенбергеру) (рН 6,0) или на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); |
| – образцы бактерий дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона; – образцы бактерий пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита; – образцы бактерий заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов биопленки получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой; – ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1,0 % раствором уранилацетата. | |
| Исследование ультраструктуры биопленки в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений ультраструктуры природной биопленки | Основные этапы: – визуализация наночастиц на ультратонких срезах биопленки; – морфометрический анализ наночастиц в структуре биопленки и клетках микроорганизмов; – определение степени полиморфизма наночастиц в структуре биопленки и клетках микроорганизмов; – определение степени агрегированности наночастиц в структуре биопленки; – оценка степени загруженности микробов наночастицами (число наночастиц на одну клетку) |
| Основные параметры и характеристики наночастиц в структуре природной биопленки для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в природной биопленке; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности наночастиц в биопленке и в микробах; –характер распределения частиц в микробах; – степень загруженности микробов наночастицами; – характер повреждений ультраструктуры микробов наночастицами; –количество бактерий в биопленке с интактной ультраструктурой; – число бактерий в биопленке с летальными повреждениями и др. |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре биопленки содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в биопленке, число частиц на один микроб, характер и степень повреждения микроорганизмов наночастицами, электронно-микроскопические изображения структуры биопленки, наночастиц и микробов.