Смекни!
smekni.com

Методические рекомендации мр 2639-10 (стр. 10 из 17)

6.4.6. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах

Для выполнения работ по визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах объектами исследований служат пробы воды, взятые на очистных сооружения промышленных городов или предприятий, пробы стоков, отобранные из канализации предприятий, а также пробы грунтовых вод, отобранные в близи промышленных предприятий.

Целью является определение наличия наночастиц в сточных и грунтовых водах, проведение структурной и морфометрической идентификации наночастиц в воде.

Для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах пробоотборником отбирают по 1-2 л воды. Каждую пробу воды выливают в химически чистую колбу со шлифом вместимостью 2-3 л. Каждую пробу воды фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров. Фильтрат выливают в химически чистую круглодонную колбу. Затем колбу, соединенную с водоструйным или роторным вакуумным насосом, помещают на водяную баню и при температуре 80-90 ºС выпаривают воду до объема 10-20 см3. Пробы фильтрата после выпаривания используют для приготовления негативно-окрашенных препаратов для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц (см. п. 6.4.6.1). Осадок с фильтра препарируют для исследования в электронном микроскопе методом ультратонких срезов (п. 6.4.6.2.).

6.4.6.1. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно-окрашенных препаратов

Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах представлена в таблице 8.

Таблица 8.

Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно окрашенных препаратов.

Объект исследования Грунтовые и сточные воды
Физическая форма Жидкость (суспензия воды, содержащая органические и неорганические примеси)
Количество материала для выполнения исследований 10-20 см3 фильтрата сточной (грунтовой) воды, полученного после медленного выпаривания 1-2 л фильтрата сточной воды
Приборное обеспечение Пробоотборник воды, роторный вакуумный насос или водоструйный насос, водяная баня, электронный микроскоп по п.6.1.1.
Материалы Круглодонные колбы вместимостью 2 или 3 л со шлифом, обеззоленные фильтры, пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки
Химические реактивы Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода
Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы сточной (грунтовой) воды фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров, фильтрат выливают в химически чистые колбы, соединенные с роторным вакуумным насосом или водоструйным насосом, фильтрат выпаривают на водяной бане при температуре 80-90 ºС до уменьшения первоначального объема в 1000-2000 раз. пробы концентрированного фильтрата выпариванием наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой; – при необходимости сеточки контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата
Исследование проб воды в просвечивающем электронном микроскопе Согласно п.6.3.
Анализ электронно-микроскопических изображений структуры наноматериала (продукта) в пробах воды Основные этапы: – визуализация наночастиц в структуре воды; – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма наночастиц в воде; – определение степени агрегированности наночастиц в воде
Основные параметры и характеристики наноматериала в сточных (грунтовых) водах для выдачи заключения Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в образце; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в воде; – степень агрегированности наночастиц в воде; – характер распределения наночастиц в воде

Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в пробах сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемых пробах воды, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, электронно-микроскопические изображения частиц в воде.

6.4.6.2. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом ультратонких срезов

Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в твердой фракции сточных и грунтовых вод представлена в таблице 9.

Таблица 9.

Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц твердой фракции сточных и грунтовых вод

Вид исследуемого материала Твердая фракция сточных и грунтовых вод или осадок
Физическая форма исследуемого материала Осадок (влажная биомасса гидробионтов и микроорганизмов)
Количество материала для выполнения исследований 100-150 мг влажной биомассы биопленки
Приборное обеспечение Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4.
Материалы Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки
Химические реактивы Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100,0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода
Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 4,0 % раствора глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – прготовление 2,0 % раствора четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией; – приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита); – заливочная эпоксидная смола; – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; –покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата; приготовление раствора цитрата свинца; приготовление эпоксидной смолы Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы осадка фиксируют и инактивируют в 4,0 % растворе глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – образцы дофиксируют в 2,0 % растворе четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – образцы дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона; образцы пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита; образцы заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 ºС; на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов осадка сточных (грунтовых) вод получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой; ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1,0 % раствором уранилацетата
Исследование ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод в просвечивающем электронном микроскопе Согласно п.6.3.
Анализ электронно-микроскопических изображений ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод, содержащего наноматериалы Основные этапы: – визуализация наночастиц на ультратонких срезах осадка сточных (грунтовых) вод; – морфометрический анализ наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток гидробионтов, микроорганизмов; – определение степени полиморфизма наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток микроорганизмов; – оценка степени загруженности гидробионтов и микробов наночастицами (число наночастиц на одну клетку); – диагностика структурных патологий в микробах; – определение числа микробов в осадке с летальными повреждениями и др.
Основные параметры и характеристики наночастиц (наноматериала) в структуре осадка сточных (грунтовых) вод для выдачи заключения Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в осадке сточных (грунтовых) вод; – уровень электронно-оптической плотности наночастиц; – форма наночастиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности наночастиц в образце; – степень загруженности микробов наночастицами; – характер повреждений ультраструктуры микробов наночастицами; –количество микробов в осадке с интактной ультраструктурой; – число микробов в осадке с летальными повреждениями и др.

Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегировнности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, число частиц на один микроб, характер и степень повреждения микроорганизмов наночастицами, электронно-микроскопические изображения наночастиц, осадка и микробов.