Учебно-методическое пособие Оренбург 2011 удк ббк л (стр. 43 из 49)

Для определения активности антиоксидантных ферментов необходимо получить эритроцитарную массу путем трехкратного отмывания крови охлажденным (5°С) физиологическим раствором. Отделение эритроцитарной массы проводится центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 10 минут. Из полученной эритроцитарной массы готовится на дистиллированной воде раствор гемолизата (1:100). Для полного гемолиза материал необходимо подвергнуть холодовому гемолизу.

В полученном гемолизате эритроцитов активность СОД определить с помощью наборов «Randox» (Великобритания).

Критерии оценки активности СОД (показатели в пределах нормы):

176,00 – 196,00 U/г. Hb.

Для определения активности каталазы исходный гемолизат развести 0,067М Na,K-фосфатным буфером (1:100). Определение активности каталазы провести кинетическим спектрофотометрическим методом прямой регистрацией разложения субстрата фермента - перекиси водорода. За единицу активности каталазы принимают такое количество фермента, которое вызывает падение оптической плотности с 0,45 до 0,4 за 17 секунд.

Состав рабочего буфера: 0,067М фосфатный буфер рН 7,2, 0,01М перекись водорода. Активность выражают в единицах активности на 1 мг гемоглобина. Все измерения выполняются на спектрофотометре Genesys 5 (США), позволяющим снимать оптическую плотность в кинетическом режиме.

Критерии оценки активности каталазы (показатели в пределах нормы):

400 - 475 U/г. Hb.

3.1.4 Определение показателей липидного спектра и активность органоспецифических ферментов в сыворотки крови.

Определение общего холестерина в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом

В основе используемого метода лежит поэтапное ферментативное окисление ЭХС. Ферментативное определение протекает в несколько стадий. На первой стадии в результате ферментативного гидролиза эфиров холестерина (с участием холестеролэстразы) идет образование холестерина и высших жирных карбоновых кислот:

Эфиры холестерина + Н₂О холестеролэстераза + холестерин + ЖК

На второй стадии образовавшийся холестерин окислятся растворенным в реакционной смеси кислородом воздуха в присутствии оксидазы ХС с образованием холест-4-ен-3-ен-она и Н₂О₂:

Холестерин + О₂ – холестеролоксидаза холест-4-ен-3-ен-он + Н₂О₂

Определение продуктов реакции (Н₂О₂) в процессе её протекания проходит по реакции Н₂О₂ с 4-Аминоантипирином в присутствии пероксидазы с образованием хинониминового красителя.

2Н₂О₂ + 4-ААР+ фенол – пероксидаза хинониминовый краситель + 4Н₂О

Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

В качестве исследуемого материала необходимо использовать сыворотку крови без следов гемолиза. Сыворотку крови в количестве 0,02 мл добавить к 2 мл рабочего реагента содержащего стандартный раствор ХС с концентрацией 35 ммоль/л, хлористый натрий 0,5 ммоль/л, фенол 28 ммоль/л, холестерол эстеразу > 0,1 Ед/мл, пероксидазу > 0,8 Ед/мл, 4-Аминоантипирин (4-ААР) 0,5 ммоль/л, перемешать и инкубировать не менее 15 минут при температуре 20-25⁰С. Калибровочная проба необходимо приготовить аналогичным образом, т.е. к 2 мл рабочего реагента добавить 0,02 мл калибратора. Контрольная проба не содержит сыворотки или калибратора, к 2 мл реагента нужно добавить 0,02 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы измеряют в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длине волны 500 нм.

Для расчета содержания холестерина в исследуемом образце необходимо использовать формулу:

, ммоль/л

Для интерпретации полученных результатов анализа необходимо использовать рекомендации ВОЗ.

Критерии оценки: нормальные показатели – до 5,17 ммоль/л (200 мг/100 мл), пограничные показатели – от 5,17 – 6,50 ммоль/л (200 до 250 мг/100 мл), патологические показатели – свыше 6,50 ммоль/л (250 мг/100 мл).

Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом

Ферментативное определение триацилглицеридов протекает в несколько стадий. На первой стадии триглицериды гидролизуются до глицерина и жирных кислот с помощью специально подобранных липаз:

Триглицериды + Н₂О – липаза глицерин + жирные кислоты

На второй стадии под действием глицерокиназы происходит фосфорилирование глицерина:

Глицерин + АТФ –глицерокиназа глицерол – 3 фосфат + АДФ

На конечной стадии процесса образуется окрашенное соединение хинонимин. Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.

Глицерол – 3 фосфат + О₂ – ГФО дигидроксиацетон фосфат + 2Н₂О₂

Н₂О₂ + 4-ААР + 4 – хлорфенол – пероксидаза хинонимин + 4Н₂О

В качестве исследуемого материала необходимо использовать сыворотку крови без следов гемолиза. 200 мкл свежей сыворотки крови добавить к рабочему реагенту, объемом 2 мл.

Рабочий реагент содержит стандартный раствор ХС с концентрацией 45 ммоль/л, хлорид магния 5 ммоль/л, 4-хлорфенол 6 ммоль/л, липазу > 100 Ед/мл, глицерокиназу > 1,5 Ед/мл, глицерол-3-фосфатоксидазу > 4 Ед/мл, пероксидазу > 0,8 Ед/мл, 4-Аминоантипирин (4-ААР) 0,75 ммоль/л, АТФ 0,9 ммоль/л; с рН = 7,0.

Калибровочная и контрольная пробы готовятся прибавлением 200 мкл калибратора или дистиллированной воды к 2 мл рабочего реагента. Пробы необходимо перемешать и инкубировать при температуре 37⁰С в течение 10 минут. Оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы измеряют в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1см при длине волны 500 нм. Расчет содержания триглицеридов в исследуемом образце проводили по формуле:

,ммоль/л

Результаты анализа интерпретировать в соответствии с величинами, рекомендованными ВОЗ.

Критерии оценки: нормальные показатели – 0,15 – 1,71 ммоль/л или 13 – 160 мг/100 мл, группа риска – 1,71 – 2,29 ммоль/л или 160 – 200 мг/100 мл, патологические показатели > 2,29 ммоль/л или 200 мг/100 мл.

Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови прямым методом

Измерения концентрации ЛПВП необходимо проводить с использованием термостатируемой кюветы при постоянной температуре 37⁰С. Сыворотку в количестве 6 мкл нужно добавить к рабочему реагенту Й объемом 750 мкл. Калибровочную пробу готовят прибавлением 6 мкл калибратора к 750 мкл реагента. Рабочий реагент должен содержать: буфер Гуда 35 ммоль/л, холестеролэстеразу ≥ 0,8 Ед/мл, холестеролоксидазу ≥ 0,5 Ед/мл, 4-аминоантипирин (4-ААР) 0,5 ммоль/л.

Пробы необходимо перемешать, кювету поместить в фотометр и инкубировать в течение 5 минут при температуре 37⁰С. По окончании инкубации определить адсорбцию А₁ при 500 нм против дистиллированной воды. Далее добавить к исследуемым образцам и калибратору 250 мкл реагента ЙЙ, содержащего 35 ммоль/л буфера Гуда, пероксидазу ≥ 1 Ед/мл и 2,4,6-трибромо-3-гидроксибензойную кислоту (ТВНВ) 0,42 г/л. Через 5 минут измерить адсорбцию А₂.

Расчет содержания холестерина ЛПВП в исследуемом образце проводят в соответствии с формулой:

, (ммоль/л)

Принцип метода заключается в том, что под действием полимера и детергента холестерин из липопротеинов высокой плотности (но не из липопротеинов низкой плотности, очень низкой плотности и хиломикрон) образца переходит в растворенное состояние. с участием сопряженных реакций, описанных ниже.

Эфиры холестерина + Н₂О – холестеролэстераза холестерин + ЖК

Холестерин + О₂ – холестеролоксидаза холест-4-ен-3-ен-он + Н₂О₂

2Н₂О₂ +4-ААР+ ТВНВ+ пероксидаза хинониминовый краситель + 4Н₂О

Критерии оценки: нормальные показатели для мужчин > 1,42 ммоль/л (55 мг/100 мл), для женщин > 1,68 ммоль/л (65 мг/100 мл), группа риска – мужчины – 0,9 – 1,42 ммоль/л (35 – 55 мг/100 мл), женщины – 1,16 – 1,68 ммоль/л (45 – 65 мг/100 мл), патология – мужчины < 0,9 ммоль/л (36 мг/100 мл), женщины < 1,16 ммоль/л (45 мг/100 мл).

Определение концентрации холестерина липопротеинов очень низкой плотности и холестерина липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови

Уровень ЛПОНП рассчитывается по формуле:

ХС ЛПОНП (ммоль/л) = Триглицериды / 2,2

Уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) рассчитывается исходя из уровня общего холестерина, триглицеридов и ХС ЛПВП. по формуле Фридвальда: ХС ЛПНП (ммоль/л) = ОХ – Триглицериды/ 2,2 – ХС ЛПВП

Критерии оценки: нормальные показатели для ЛПНП ≥ 3,9 ммоль/л (150 мг/100 мл), патология ≥ 4,9 ммоль/л (190 мг/100 мл).

Отражением дислипопротеинемии может служить коэффициент атерогенности. Коэффициент атерогенности, иначе индекс атерогенности, является характеристикой атерогенной направленности липидного спектра. Индекс атерогенности рассчитывается как отношение содержания ХС в ЛПНП и ЛПОНП к его содержанию в ЛПВП.