работа (стр. 1 из 2)

Московский Государственный Университет

им. М. В. Ломоносова.

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Щербинин Дмитрий Сергеевич

Компьютерная аннотация

стрептомицинового оперона бактерий

Курсовая работа

Научный руководитель:

Рассохин Т. И.

Москва

2003 г.

Аннотация

Стрептомицин - антибиотик, образующийся в процессе жизнедеятельности лучистых грибов Streptomyces globisporus streptomycini или других родственных микроорганизмов.

Стрептомицин обладает широким спектром антимикробного действия. Антибиотик активен в отношении микобактерий туберкулеза, а также большинства грамм-отрицательных бактерий (кишечная палочка, палочка Фридлендера, палочка инфлюэнцы, возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза) и некоторых грамм-положительных (стафилококки) микроорганизмов; менее активен в отношении стрептококков, пневмококков. Не действует на анаэробы и риккетсии. Действует стрептомицин бактерицидно. Эффект связан с подавлением синтеза белка на рибосомах. Наиболее серьёзным препятствием при лечении туберкулёза - возросшая первичная (исходная) лекарственная устойчивость возбудителей заболевания: в 3 и более раза по сравнению с 60-ми годами; инфицирование населения микобактериями, приобретшими резистентность в процессе лечения. [1]

Введение

В структуру стрептомицинового оперона E. coli входят гены рибосомных белков малой субчастицы S12 (rpsL) и S7 (rpsG), транляционных факторов EF-G и EF-Tu. Белок S7 является регуляторным белком стрептомицинового оперона. При отсутствии свободной рРНК в клетках E.coli белок S7 связывается с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует синтез белков стрептомицинового оперона [2-4] (Рис. 1). Длина межцистронного фрагмента между стоп-кодоном белка S12 и старт-кодоном белка S7 – около 100 нуклеотидов.

Рис. 1. Модель вторичной структуры межцистронного фрагмента S12-S7 E. coli.

Фенотипическая устойчивость E. coli к антибиотику стрептомицину обеспечивается мутациями в гене белка S12. Поскольку стрептомицин является важным терапевтическим агентом в медицине и ветеринарии, изучение регуляции синтеза белков стрептомицинового оперона и филогенетический анализ известных бактериальных оперонов является актуальной проблемой. При общей высокой степени гомологии между рибосомными белками в различных организмах размеры и нуклеотидный состав межцистронной области, ответственной в E. coli за регуляцию экспрессии генов оперона отличаются. Выявление общих закономерностей и установление основных регуляторных районов в стрептомициновых оперонах необходимо для полного понимания процесса регуляции и разработки новых терапевтических агентов.

Цель данной работы – определить, является ли такой механизм аутогенной регуляции белком S7 собственного синтеза уникальным для E. coli, или же существуют бактерии со схожим механизмом.

Материалы и методы

1. Построение выравнивания всех известных рибосомных белков S7 эубактерий, определение позиции старт-кодона.

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены нуклеотидные последовательности изученных эубактерий*:

Actinobacteria; Aquificiales; Cyanobacteria; Cytophagales; Spirochagales; Chlamydiales; Thermotogales; Thermus (Deinococculus); CFB(Green sulfur); Green non-sulfur;

Pasteurellaceae; Salmonella; Pseudomonas; Emterobacteriaceae; Rhodospirillaceae; Sphingomonadaceae; Rhodobacter; Rhizobiaceae; Ricketsiales; Caulobacter; Bordetella;

Neisseria; Burkholderia; Bacillus; Clostridium; Staphylococcus; Heliobacterium; Mollicutes; Streptococcus; Enterococcus.

Жирным шрифтом выделены найденные и использованные в работе геномы бактерий.

a) Для поиска был выбран банк EMBL.

b) В окне “Organism name” были поочерёдно введены названия соответствующих групп эубактерий (см. список бактерий)

с) В окне “Features: Gene” было введено rpsG,

d) В другом, таком же окне было введено rpsL (для того, чтобы в найденных последовательностях был не только ген белка S7, но и S12)

Записаны позиции (начало и конец) гена rpsG, учитывая, что среди найденных последовательностей могут быть как прямые (rpsL расположен до rpsG), так и комплементарные (rpsL расположен после rpsG). Для построения комплементарных последовательностей использована программа Revseq из пакета EMBOSS.

2. Экстракция нуклеотидных последовательностей области слева от старт-кодона белка S7, построение выравнивания полученных межцистронных фрагментов.

При помощи программы CutseQ из найденных последовательностей был выделен участок, отстоящий от начала rpsG на 200 нуклеотидов (т.к. близкие к str оперону E. сoli участки могут находиться как между генами S7 и S12 белков, так и в конце гена rpsL).

Используя программу Alibee

(http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html), построено выравнивания полученных участков (межцистронный фрагмент + часть rpsL)

3. Систематизация, сортировка и аннотация найденных межцистронных фрагментов.

С помощью программы GeneDoc были построены выравнивания межцистронных областей семейств бактерий в сравнении с межцистронным фрагментом E. coli.

4. Построение филогенетического дерева эубактерий.

Исходя из полученных выравниваний белков S7 и межцистронных областей бактерий построены филогенетические деревья эубактерий. Для выполнения данной задачи была использована программа, расположенная на сайте http://www.genebee.msu.su/services/phtree_reduced.html

Результаты и обсуждение

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены все известные геномы эубактерий. Найденные последовательности были систематизированы и унифицированы по ориентации.

При помощи программы Alibee (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) было построено общее выравнивание всех найденных последовательностей генов белка S7, а также участков между генами S12 и S7. При помощи этой же программы было построено филогенетическое дерево бактерий (Рис. 2, 3).

При помощи программы GeneDoc были проанализированы полученные выравнивания нуклеотидных последовательностей участков S12 - S7 белков бактерий, относящихся к одной филогенетической группе и последовательность такого же участка генома E. coli. Выравнивание позволяет найти у изучаемых последовательностей участки, гомологичные фрагменту стрептомицинового оперона E. coli.

Рис. 2. Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по белку S7

Рис. 3. Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по межцистронному фрагменту S12-S7.

В филогенетическом дереве, построенном по белку S7, бактерии располагаются в соответствии с их родственными связями. По построенному же по межцистронным участкам видно, что бактерии можно зразделились на 2 группы:

1) Представители, имеющие соответствующие участки, близкие к E. сoli.

2) Бактерии, проявляющие значительную вариабельность данных межцистронных участков.

Найденные и использованные в работе геномы бактерии

Далее приведены выравнивания фрагментов с наибольшей степенью гомологии. В участках геномов остальных групп бактерий расхождение с E. сoli значительно больше.

MLB1790G- Mycobacterium leprae Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.	MLEPRTN7- Mycobacterium leprae Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.
MTV040- Mycobacterium tuberculosis H37Rv Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium; Mycobacterium tuberculosis complex; Mycobacterium tuberculosis.	MSRPSLG- Mycobacterium smegmatis Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.
SRU60191- Streptomyces roseosporus Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Streptomycineae; Streptomycetaceae; Streptomyces.	AE014733- Bifidobacterium longum NCC2705 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium; Bifidobacterium longum.
AE009147- Agrobacterium tumefaciens str. C58 (U. Washington) Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium; Agrobacterium tumefaciens; Agrobacterium tumefaciens str. C58.	AY099291- Rhodobacter capsulatus Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Rhodobacter.
AE014017- Buchnera aphidicola str. Bp (Baizongia pistaciae) Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola; Buchnera aphidicola (Baizongia pistaciae).	AP001119- Buchnera aphidicola str. APS (Acyrthosiphon pisum) Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola; Buchnera aphidicola (Acyrthosiphon pisum).
AE014125- Buchnera aphidicola str. Sg (Schizaphis graminum) Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola; Buchnera aphidicola (Schizaphis graminum).	AE005558- Escherichia coli O157:H7 EDL933 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.
AE015345- Shigella flexneri 2a str. 301 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Shigella; Shigella flexneri; Shigella flexneri 2a.	AE016767- Escherichia coli CFT073 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.
AE008858- Salmonella typhimurium LT2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella typhimurium.	AE016848- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella enterica; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi.
AL627281- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella enterica.	ECAE410- Escherichia coli K12 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.
NMA1Z2491- Neisseria meningitidis Z2491 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Neisseria; Neisseria meningitidis; Neisseria meningitidis serogroup A.	AE004842- Pseudomonas aeruginosa PAO1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas aeruginosa.
AE016858- Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas syringae; Pseudomonas syringae pv. tomato.	AE016775- Pseudomonas putida KT2440 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas putida.
AE016852- Tropheryma whipplei str. Twist Bacteria; Actinobacteria; Tropheryma; Tropheryma whipplei.	BX251412- Tropheryma whipplei TW08/27 Bacteria; Actinobacteria; Tropheryma; Tropheryma whipplei.
AP001507- Bacillus halodurans Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.	BSD127- Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.
AE016947- Enterococcus faecalis V583 Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Enterococcaceae; Enterococcus; Enterococcus faecalis.	AP003130- Staphylococcus aureus subsp. aureus N315 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus; Staphylococcus aureus subsp. aureus.
AP003359- Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus; Staphylococcus aureus subsp. aureus.	AP004823- Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus; Staphylococcus aureus subsp. aureus.
AE006493- Streptococcus pyogenes M1 GAS Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus pyogenes.	AE009973- Streptococcus pyogenes MGAS8232 Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus pyogenes.
AE014140- Streptococcus pyogenes MGAS315 Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus pyogenes.	AE014272- Streptococcus agalactiae 2603V/R Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus agalactiae; Streptococcus agalactiae serogroup V.
SAG766853- Streptococcus agalactiae NEM316 Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus agalactiae; Streptococcus agalactiae serogroup III.	AE008406- Streptococcus pneumoniae R6 Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus; Streptococcus pneumoniae.
AP003194- Clostridium perfringens str. 13 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae; Clostridium; Clostridium perfringens.	MPAE58- Mycoplasma pneumoniae Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; Mycoplasmataceae; Mycoplasma.
AE002340- Chlamydia muridarum Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae; Chlamydia.	AE016994- Chlamydophila caviae GPIC Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae; Chlamydophila; Chlamydophila caviae.
AE008584- Rickettsia conorii Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; Rickettsieae; Rickettsia; spotted fever group.	RP02603- Rickettsia prowazekii Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; Rickettsieae; Rickettsia; typhus group.
BSUB0001- Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus subtilis; Bacillus subtilis subsp. subtilis.	AB017508- Bacillus halodurans Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.