При положительной уреазной активности, ферментации глюкозы и отсутствии газообразования в первые 24 часа при 37°С исключают все газообразующие энтеробактериии родов: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Hafnia. Способность ферментировать арабинозу исключает еще два рода – Proteus, Serratia, отсутствие ферментации инозита исключает род Klebsiella. Внутри родовая дифференциация Yersinia проводится с использованием следующих биохимических тестов: положительные результаты ферментации сахарозы, целлобиозы, сорбозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, мелибиозы, раффинозы при положительном тесте на уреазу и подвижность при 25°С могут свидетельствовать о принадлежности выделяемой культуры к бактериям вида Yersinia enterocolitica.
Внутривидовая дифференциация выделенных культур Yersinia enterocolitica делается с целью типирования биовариантов и проводится по следующим тестам: положительные результаты на индол, ксилозу, салицин, трегалозу указывают на принадлежность штаммов к 1 биовару, отрицательные результаты по этим тестам свидетельствуют о принадлежности штаммов к 5 биовару. Штаммы 2 биовара из указанных 4-х тестов дают отрицательные показатели только по салицину. Штаммы 4 биоварианта имеют из данных 4-х тестов положительный результат только по трегалозе. Штаммы 3 биовара дают отрицательные результаты по тестам на салицин и индол и положительные результаты по тестам на ксилозу и трегалозу. Биоварианты 2, 3, 4 являются наиболее патогенными для человека.
При исследовании по третьему этапу проводят одновременно постановку по всем необходимым тестам, что сокращает сроки исследования выделенной культуры.
При соответствии полученных результатов по тестированию выделенной культуры с вышеуказанными данными полученный бактериальный штамм определяют как бактериальную культуру вида Yersinia enterocolitica.
В случае, если изучаемая бактериальная культура не типируется как бактерии вида Yersinia enterocolitica, возможен вариант повторного использования бактериальной суспензии со средой накопления, хранящейся в холодильнике при +4°С.
Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии проб.
Общие сроки бактериологического исследования материала - в пределах 7 суток.
Идентификация вида осуществляется биохимическими и серологическими методами.
Для проведения ускоренной диагностики заболевания можно использовать чумной бактериофаг. Бактериофаг Y. pestis выделяют из различных источников, включая ткани больного человека и животных, а также блох. Многие авторы связывают естественное быстрое угасание заболевания в очаге с наличием бактериофага. Его высокая специфичность и вирулентность для чумной палочки позволяют применять его для идентификации чумы внесением в исследуемый материал перед посевом либо по увеличению титра бактериофага в среде.
Для быстрого обнаружения также применяют AT, меченные флюоресцинами (позволяют обнаружить Y. pestis в различных объектах в течение первых 2 ч исследования), реакцию нейтрализации AT, реакцию преципитации в стандартных агаровых пластинках и метод ускоренного роста Y. pestis на средах обогащения.
Также разработаны методы, ускоряющие биологическую пробу, например, введение зараженным животным глюкокортикоидов или куриного желтка, что позволяет ускорить диагностику чумы в случаях снижения вирулентности или при применении малой заражающей дозы.
Основные биохимические свойства, дифференцирующие Y.pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, представлены в таблицах 15 и 16. Дополнительными признаками могут служить результаты реакции Фoгеса-Проскауэра: всегда отрицательные у Y. pseudotuberculosis и положительные при 22-28°С у Y. enterocolitica. В последнее время для выделения Y.enterocolitica из фекалий предложена селективная среда, содержащая цефсулодин, иргазан и новобиоцин (CIN-агар).
Питательные среды для культивирования иерсиний
Раствор А: KH2PO4 – 9,08 г в 1,0 л дистиллированной воды; раствор Б: Na2HPO4 ´ 2H2O – 11,87 г в 1 л дистиллированной воды (pH 7,6-7,8). 150 мл раствора А соединить с 850 мл раствора Б. Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать при 1 атм. в течение 1 часа.
Гидролизат казеина средней степени расщепления – 2,0 мл (Дагестанский НИИ питательных сред); экстракт пекарских дрожжей – 5,0 мл; фосфатно-буферный раствор (pH 7,6-7,8) – до общего объема 1 л. Экстракт пекарских дрожжей: к 500 г дрожжей, предварительно размельченных до гомогенной массы в фарфоровой ступке в малом объеме дистиллированной воды добавить до 1 л дистиллята. Взвесь слить в колбу и кипятить в течение 60 минут на медленном огне при помешивании. Взвесь охладить при 5°С в течение 16-18 часов. Затем надосадочную жидкость слить и профильтровать через широкопористый бумажный фильтр. Приготовленный дрожжевой экстракт разлить во флаконы, простерилизовать под давлением 0,5 атм. 30 минут; хранить при температуре 5-8°С в течение 12 месяцев.
К 0,5 л фосфатно-буферного раствора добавить 2,0 г гидролизата казеина (предворительно подготовленного согласно указаниям на этикетке) и 5,0 мл экстракта дрожжей. Смешать встряхиванием, добавить фосфатно-буферный раствор до общего объема 1 л и проверить pH готовой среды (должен быть 7,6-7,8). Далее смесь разлить в пробирки по 5,0 мл и автоклавировать под давлением 0,5 атм. в течение 20 минут. Среду можно использовать в течение 7-10 суток при хранении в условиях холодильника.
Глюкоза 0,5 г
Мочевина 0,25 г
Молибденовокислый аммоний 0,1 г
Сода безводная 0,1 г
30% водный раствор сухой желчи 2,0 мл
1,6% водный раствор конго-рот 0,8 мл
1% водный раствор генцианвиолета 0,1 мл
Сухой агар 3,5 г
Дистиллированная вода 100,0 мл
Конго-рот и генцианвиолет растворить в горячей дистиллированной воде. Раствор сухой желчи готовить в стерильной воде.
Указанные ингредиенты вносить в дистиллированную воду, нагревать и кипятить 5 минут при помешивании, разлить в чашки Петри. Цвет среды темно-вишневый, pH — 7,2-7,4. Среду можно хранить в течение недели в холодильнике.
Желчь медицинская 20 мл
Раствор NaOH 4% 10-12 капель
Сухой питательный агар 35 г
Глюкоза 10 г
Мочевина 5 г
1,6% спиртовой раствор с индикатором
бромтимоловым синим 8 мл
Дистиллированная вода 1 л
К 1 л воды добавить сухой питательный агар, медицинскую желчь и автоклавировать 20 минут при 0,5 атм. После охлаждения до 80°С добавить глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий, смешать и сразу разлить в стерильные чашки Петри, pH – 7,8. Хранить среду при температуре 5-8°С в течение недели.
Агар сухой питательный 3,5 г
Лактоза 0,4 г
Глюкоза 0,08 г
Крахмал растворимый 0,05 г
Сахароза 1,5 г
Мочевина 0,25 г
Уксуснокислый свинец 0,3-0,04 г
Тиосульфат натрия 0,03 г
Цистин 0,003 г
1% феноловокрасный
водорастворимый 2,5 мл
Дистиллированная вода 100 мл
Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10-15 минут, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 минут, после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.
Раствор А – калия гидроокись 400 г; вода дистиллированная до 1 л. Раствор В – натрия хлорид 5,0 г; вода дистиллированная до 1 л. Оба раствора приготовить отдельно и хранить в условиях холодильника. Перед началом работы приготовить рабочий раствор, смешивая 9,7 мл раствора В и 0,13 мл раствора А. Щелочной раствор должен быть прозрачным.
Двузамещенный фосфат калия 5,0 г
Пептон 7,0 г
Глюкоза 5,0 г
Вода до 1 л
Пептон и фосфат калия растворить в воде и кипятить 2-5 минут. После удаления осадка среду стерилизовать при 120°С в течение 20 минут, асептично добавить стерильный раствор глюкозы и разлить по 3-4 мл в пробирки.
Микроорганизмы рода Pasteurella
Pasteurella — род паразитических бактерий, вызывающих поражения у млекопитающих и птиц. Пастереллезы (геморрагическая септицемия) - инфекционная болезнь многих видов сельскохозяйственных животных, птиц и людей. Она характеризуется явлениями септицемии и воспалительно-геморрагическими процессами во внутренних органах, на серозных и слизистых оболочках. Родовое название, по предложению Trevisan дано в честь Луи Пастера, установившего их патогенность. Микроорганизмы впервые были обнаружены при холере кур (Perroncito, Semmer, 1878). Выделены и обстоятельно изучены Pasteur (1880). Позднее данный возбудитель был выделен при септицемии кроликов (Gaffks, 1881), Боллингеревской повальной болезни диких животных (Kitt, 1883), септицемии свиней (Loeffler, 1886), септической плевропневмонии телят (Poels, 1886), повальной болезни буйволов (Orste, Armanni. 1887), септицемии овец (Galtier, 1889). P.multocida выделена из пищеварительного или респираторного тракта домашних кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, северных оленей, лошадей, обезьян, львов, пантер, волков, опоссумов.
Под названием Pasteurella multocida в 1939 г. Rosenbush, Merchant объединили возбудителей куриной холеры и септицемии КРС. Тем самым они узаконили точку зрения Kitt (1885) и Hueppe (1886) о родстве этих микроорганизмов. Микроорганизмы данного рода объединены в 14 видов и представлены короткими овоидными палочками. Неподвижны, не образуют эндоспор; при окраске по Романовскому-Гимзе или метиленовым синим дают биполярное окрашивание (особенно в препаратах из живых инфицированных тканей); в мазках расположены одиночно, реже — парами или короткими цепочками. Хемоорганотрофы; лучше растут на средах, содержащих кровь; метаболизм бродильный; углеводы ферментируют с образованием кислоты; восстанавливают нитраты. Каталазоположительны, почти всегда оксидазоположительны, желатиназоотрицательны; реакции с метиленовым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательны. Аэробы (факультативные анаэробы); температурный оптимум 37°С. Род включает много видов, основные из которых — Р.multocida с подвидами (multocida, septica и gallicida), P. dagmatis, P. gallinarum, P. canis, P. stomatis, P. anatis, P. langaa, P. avium, Р. aerogenes, P. haemolytica, P. pneumotropica и Р. volantium. Типовой вид — Р. multocida. Систематику рода нельзя считать законченной; на основании изучения ДНК-гомологии Р. aerogenes, Р. haemolytica, Р. urеае и Р. pneumotropica оказались близки к бактериям рода Actinobacillus и частично включены в его состав (Р.urеае). Дифференциальные признаки некоторых видов рода Pasleurella даны в табл. 17. Часто входят в состав микрофлоры дыхательных путей и глотки многих животных и птиц. При неблагоприятных условиях (обычно на фоне стресса) Р. multocida способна вызывать пневмонии и сепсис у животных (заболевания известны как транспортная лихорадка и куриная холера, гемморагическая септицемия). P. haemolytica – возбудитель септицемии ягнят и пневмонии КРС и овец. Заболевания человека до настоящего времени слабо изучены.