«Совершенствование иммуноферментной диагностики туберкулеза» Работа выполнена в отделе новый технологий нииэм имени Пастера в 2008 г., научный руководитель Вербов В. Н. Содержание (стр. 1 из 6)

Литературный обзор из дипломной работы студентки Санкт-Петербургского государственного технологического института Васильевой Е.В. на тему «Совершенствование иммуноферментной диагностики туберкулеза»

Работа выполнена в отделе новый технологий НИИЭМ имени Пастера в 2008 г., научный руководитель Вербов В.Н.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Микобактерии туберкулеза

2. Методы диагностики туберкулеза

2.1 Бактериологические методы

2.2 Молекулярно – генетические методы

3. Иммуноферментный анализ

3.1 Общие этапы в различных вариантах ИФА ……………………………21

3.2 Компоненты ИФА…………………………………………………..……25

3.3 Специфичность и чувствительность ИФА………………………………38

3.4 Использование рекомбинантного антигена ESAT-6 в твердофазном ИФА……………………………………………………………………………….

Заключение

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

Туберкулез легких в настоящее время продолжает оставаться одной из наиболее острых социально-экономических проблем, без решения которой нельзя прогнозировать положительное развитие государственных стратегических программ (Перельман с соавт., 2006). Анализ эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в нашей стране носит характер эпидемии(Онищенко Г.Г., 2002). В России показатель заболеваемости туберкулезом всего населения в 2006 году составил 83,1 на 100 000 населения, смертности – 19,5 на 100 000. Особую тревогу вызывает непрекращающийся рост заболеваемости и смерности от туберкулеза среди трудоспособного населения.

На данный момент существуют следующие методы диагностики туберкулеза:

1. Туберкулинодиагностика

2. Флюрография

3. Рентгенография

4. Бронхоскопия

5. Бактериологические методы

6. Молекулярно-генетические методы

7. Культивирование

8. ИФА

1.МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Микобактерии туберкулеза (МБТ) – факультативные внутриклеточные паразиты. Относятся к семейству бактерий Micobacteriacae, порядку Actinomycetalis, роду Mycobacterium .

МБТ относятся к прокариотам; в их цитоплазме нет высокоорганизованных органелл (митохондрий, аппарата Гольджи, лизосом).

Форма - слегка изогнутая или прямая палочка 1—10 мкм × 0,2—0,6 мкм. Концы слегка закруглены. Обычно они длинные и тонкие, но возбудители бычьего вида более толстые и короткие. В зависимости от возраста, состава среды форма и размеры клетки могут меняться. МБТ неподвижны, не образуют эндоспор и капсул.

В бактериальной клетке дифференцируется:

1. микрокапсула — стенка из 3—4 слоев толщиной 200—250 нм, прочно связана с клеточной стенкой, состоит из полисахаридов, защищает микобактерию от воздействия внешней среды, не обладает антигенными свойствами, но проявляет серологическую активность;

2. клеточная стенка — ограничивает микобактерию снаружи, обеспечивает стабильность размеров и формы клетки, механическую, осмотическую и химическую защиту, включает факторы вирулентности — липиды, с фосфатидной фракцией которых связывают вирулентность микобактерий;

3. гомогенная цитоплазма;

4. цитоплазматическая мембрана — включает липопротеиновые комплексы, ферментные системы, формирует внутрицитоплазматическую мембранную систему (мезосому);

5. ядерная субстанция — включает хромосомы и плазмиды.

Белки (туберкулопротеиды) являются главными носителями антигенных свойств МБТ и проявляют специфичность в реакциях повышенной чувствительности замедленного типа. К этим белкам относится туберкулин. С полисахаридами связано обнаружение антител в сыворотке крови больных туберкулёзом. Липидные фракции способствуют устойчивости микобактерий к кислотам и щелочам .

Mycobacterium tuberculosis — аэробные, Mycobacterium bovis и Mycobacterium africanum — аэрофилы.

Микобактерии туберкулеза медленно растут на искусственных питательных средах (2-3 недели).

2.МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Существуют различные методы диагностики туберкулеза. Далее будут рассмотрены некоторые из них.

2.1 Бактериологические методы

Микроскопия мазка

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения .

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения – возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия.

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

а в

б г

Рисунок 1 – Микобактерии туберкулеза

а – метод окраски по Цилю-Нельсену

б – метод люминисцентной микроскопии

в – клетки Лангхаса

г – эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это “золотой стандарт” бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.