Ферментный коньюгат
Последним компонентом специфического комплекса на твердой фазе является коньюгат. Коньюгат – вещество (антивидовые антитела), содержащее ферментную метку и способное специфически связываться с антителом. Образующиеся иммунные комплексы антиген-антитело выявляют с помощью коньюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами.
Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок - фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок - фермент состава 1:1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. При уменьшении числа молекул фермента, связанных с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецифических взаимодействий конъюгата. Из реакционной смеси конъюгаты выделяют диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.
Методы получения конъюгатов, т.е. комплексов фермента со специфическим реагентом, разделяют на химические и иммунохимические. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируются реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между модифицированным ферментом, приводящую к образованию конъюгата по типу антиген-антитело.
Фермент реагирует с вводимым на последний стадии анализа субстратом. Ферментная активность коньюгата, а, следовательно, и концентрация будет пропорциональна концентрации остальных компонентов комплекса, один из которых подлежит определению. За счет сопряженной ферментативной реакции обуславливается высокая чувствительность ИФА (до 10-21молей). Применение ферментной метки позволяет создавать каскадные системы усиления слабых химических сигналов.
Существует достаточно большое число ферментов, используемых в ИФА. В ИФА туберкулеза в качестве фермента чаще применяется пероксидаза хрена. А субстратом для этого фермента является тетраметилбензидин (ТМБ).
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела, использующиеся в тест – системах иммунофементного анализа, позволяет существенно повысить специфичность этого метода, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом.
Для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, — моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а, приобретя способность к делению от клетки совместимого типа — расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью.
Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гибридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном.
Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизаций, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток. Особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК. Этот фермент обеспечивает запасной путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора - аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда), такие миеломные клетки размножаться не способны. Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ). Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы—селезенки, миеломы-миеломы, селезенки-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки-селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов — при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки и слипшиеся клетки миеломы—миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.
Слившиеся клетки селезенки-миеломы растут в среде ГАТ, поскольку: 1) клетки селезенки поставляют функциональную гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином;
2) клетки миеломы способны активно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10-14-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки-миеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальпых плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.
Селекция на ГАТ-среде позволяет избавиться от миеломных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).
Не все клетки, растущие на ГАТ-среде, являются гибридомами - продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важным этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену.
Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном.
К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно вымоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.
Однако выявленные на этой стадии антитела не обязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Для этого клеточную суспензию разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.