7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе
Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при 105ОС до постоянного веса.
Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6 часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный от примесей углеводородов гексан.
Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема. Затем в него добавляли около 1г активированного силикагеля (Silpearl) и упаривали досуха. Далее пробу вносили в разделительную колонку с силикагелем и вымывали посторонние примеси 40мл гексана. Затем элюировали фракцию ПАУ 120мл смеси гексан:хлористый метилен (4:1). Фракцию, содержащую ПАУ упаривали до объема 0,25-1,0мл.
Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70 до 320ОС со скоростью 4ОС в минуту. Количественные данные получали методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами ПАУ (’’Экрос’’, Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену осуществляли при помощи ГСО 7064-93.
Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс-спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция). Хроматографические условия были те же, что и в случае количественного анализа. Идентификацию проводили путем сравнения масс-спектров электронного удара при помощи компьютерной информационно-логической системы ’’Компас-МС’’.
7.2.Результаты и обсуждение
7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ
Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия стала объектом интенсивных исследований практически во всех развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов. Необходимость интенсифицировать процессы биоремедиации побуждает исследователей как к проведению селекции коллекционных штаммов, так и к поиску новых деструкторов /44-46/.
Проведенные эколого-таксономические исследования показали, что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria, Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium и др.), а так же почвенной микрофлоры ( рода Aspergillus, Trichoderma, Penicillium и др.) способны разлагать лигниноцеллюлозу и разрушать ароматические ядра лигнина /34/.
Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные аромитические вещества (Fusarium) /34/.
Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по нашему мнению, для биоремедиации следует использовать микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и быстрорастущие штаммы.
Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная Ван-Итерсона /42/, где полоска фильтровальной бумаги была инпрегнированна ПАУ. На такой среде селективно отбираются ПАУ-резистентные микроорганизмы. Для отработки методики и с целью поиска штаммов-деструкторов ПАУ нами из техногенных биоценозов был выделены ряд микроорганизмов.
Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано 5 проб древесины, имеющей ярко выраженные биоповреждения. Пробы помещали в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками высушивали и хранили при обычных условиях.
Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток, температура поддерживалась на уровне +25ОС.
Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum, Trichoderma sp. и три представителя рода Fusarium. Хранили штаммы на модифицированной среде Ван-Итерсона. Во избежании путаницы штаммам были присвоены музейные номера (см. табл.3. ).
таблица 3
| № п.п. | видовое название штамма | музейный номер* |
| 1 | Trichoderma linorum | Н-1 |
| 2 | Trichoderma sp. | Н-2 |
| 3 | Fusarium sp. | Н-3 |
| 4 | Fusarium sp. | Н-4 |
| 5 | Fusarium sp. | Н-5 |
*Н- Новгородский рег., 1- порядковый № штамма
Для проведения исследований мы использовали культуры, выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные, любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. Результаты представлены в таблице 4.
таблица 4
| № | название | коллекцион- ный/музейный | колонизация поверхности субстрата, % | |||||||
| п.п. | штамма | номер | время инкубации, сутки | |||||||
| штамма | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 20 | ||||
| 1 | Trichoderma lignorum | 32 | 0 | 0 | 2 | 4 | 2 | 2 | ||
| 2 | Trichoderma lignorum | 37 | 0 | 10 | 30 | 45 | 60 | 60 | ||
| 3 | Trichoderma lignorum | 48 | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| 4 | Trichoderma linorum | Н-1 | 0 | 0 | 10 | 15 | 15 | 20 | ||
| 5 | Trichoderma sp. | Н-2 | 0 | 5 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| 6 | Chaetomium elatum | 341 | 0 | 2 | 4 | 4 | 8 | 4 | ||
| 7 | Chaetomium bainieri | 344 | 2 | 2 | 2 | 4 | 2 | 2 | ||
| 8 | Chaetomium funicolum | 347 | 0 | 4 | 4 | 6 | 4 | 2 | ||
| 9 | Chaetomium coclioides | 491 | 0 | 0 | 4 | 6 | 6 | 2 | ||
| 10 | Coriolus versicolor | 330 | 0 | 0 | 6 | 8 | 2 | 2 | ||
| 11 | Fusarium solani | 464 | 0 | 0 | 4 | 6 | 6 | 6 | ||
| 12 | Fusarium solani | 496 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | ||
| 13 | Fusarium sp. | Н-3 | 0 | 0 | 4 | 6 | 6 | 6 | ||
| 14 | Fusarium sp. | Н-4 | 0 | 2 | 6 | 8 | 8 | 8 | ||
| 15 | Fusarium sp. | Н-5 | 0 | 0 | 6 | 6 | 6 | 6 | ||
Практически все исследуемые микроорганизмы обладали способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата. Однако у большинства культур процент заселения поверхности субстрата был незначителен (до 10%). По-видимому таким культурам требуется более длительный срок адаптации или наличие стимуляторов роста. Наибольшей скоростью роста и высокой степенью колонизации (до 60% площади субстрата) обладал штамм Trichoderma lignorum №37. Характер роста данного микроорганизма соответствовал каталожному описанию и заключался на начальных этапах в образовании небольших колоний диаметром 1-1,5 мм, постепенно сливающихся в единое целое и формирующих поверхностный мицелий светло зеленого цвета. Этот штамм и был отобран для дальнейших исследований.
7.2.2.Микробная деструкция смеси ПАУ
Анализ литературных данных показал, что основная масса работ по деструкции ПАУ посвящена изучению деструкции одного вещества или смеси ПАУ/6,11,14/, содержащей не более 5 компонентов. Однако в реальных условиях спектр ПАУ-экотоксикантов гораздо шире. Данные по деструкции многокомпонентных смесей ПАУ в доступной литературе отсутствуют. Между тем изучение процессов деструкции смеси экотоксикантов имеет очень важное значение для разработки процессов биоремедиации.
Для изучения деструкции смеси ПАУ нами в качестве модельного субстрата была выбрана древесина шпал. Использование этого субстрата значительно упрощало работу так как отпадала необходимость работать с креозотом непосредственно.
Для приготовления ферментационной среды субстрат измельчали до фрагментов размером около 5 мм и увлажняли жидкой средой Чапека с сахарозой (см.разд.7.1.). Посевной материал выращивали в чашках Петри на такой же среде. Объем ферментационной среды составлял 250гр., посевной материал вносился в количестве 10-ти % от объема среды. Температура культивирования составляла 25оС, пробы отбирались на 14-е и 20-е сутки инкубации. Содержание ПАУ в экспериментальных образцах определяли методом хромато-масс-спектроскопии (см.разд.7.1.). Результаты анализа представлены в таблице 5:
таблица 5
| вещество | содержание ПАУ в образцах, мг/кг | ||
| контроль | 14 суток | 20 суток | |
| Нафталин | 22 | 0,4 | 0,1 |
| Аценафтен | 7 | 2,2 | 0,4 |
| Аценафтилен | 86 | 1,5 | 0,4 |
| Флуорен | 86 | 3,1 | 2,9 |
| Фенантрен | 1840 | 87 | 43 |
| Антрацен | 600 | 24 | 12 |
| Флуорантен | 1430 | 350 | 210 |
| Пирен | 520 | 100 | 71 |
| Бензантрацен | 230 | 8 | 2,7 |
| Хризен | 160 | 22 | 15 |
| Бенз(b)флуорантен | 45 | 12 | 4,3 |
| Бенз(k)флуорантен | 34 | 3,6 | 27 |
| Бенз(a)пирен | 35 | 5,9 | 2,8 |
| Дибензантрацен | 18 | 2,7 | 4,4 |
| Бензперилен | 10 | 4,7 | 21 |
| Инденопирен | 9 | 3,4 | 16 |
Анализ экспериментальных данных по деструкции ПАУ, приведенные в табл.45 показал, что различные по строению ПАУ разрушаются Trichoderma lignorum с различной скоростью. Простые ПАУ, такие как нафталин, антрацен, фенантрен в большей степени подвержены деструкции, чем многоядерные. Литературные /40/ данные свидетельствуют, что микробная деструкция нафталина ферментами оксигеназами происходит последовательно и начинается с гидроксилирования только одного аромтического кольца (см. рис.6.).