Техника жидкостной, колоночной хроматографии (стр. 2 из 2)

У фирменных колонок все описанные операции упрощаются благодаря наличию специального «адаптера». Способ его использования приводится в техническом описании колонки.

Стоит упомянуть еще об одной «мелочи». Крайне нежелательно попадание в любой участок жидкостного тракта, обслуживающего хроматографическую колонку, пузырьков воздуха. Поэтому соединение любых двух полиэтиленовых трубочек этого тракта (обычно через переходник из силиконовой резины) следует производить так, чтобы переходник на нижней трубочке был заполнен с выступающим мениском, а на конце верхней трубочки висела капелька (или даже текла жидкость). Капелька сливается с мениском и в этом свободном от воздуха «окружении» верхняя трубочка вставляется в переходник.

Перистальтический насос

Перистальтические насосы могут создавать давление на входе в колонку до 5 атмосфер и в очень широком диапазоне варьировать скорость подачи жидкости: от сотых долей миллилитра до тысяч миллилитров в час. Главное их отличие еще в том, что нагнетаемая жидкость в насосе не контактирует ни с чем, кроме трубочки из силиконовой резины, внутри которой она находится. Кроме того перистальтические насосы обеспечивают минимум пульсации и возможность плавной регулировки скорости подачи жидкости. На рис. 3а изображена схема рабочей части перистальтического насоса роликового типа.

Рис. 3

6 роликов свободно сидящих на своих осях расположены по периферии плоского, вращающегося диска. Регулируемая винтом пластинка в любой момент времени прижимает весьма эластичную резиновую трубку к трем нижним роликам так, что жидкость внутри трубки выдавливается из-под роликов и собирается в двух вздутиях между ними. Ролики прокатываются по трубке. В следующий момент времени правый ролик отойдет вверх и освободит выход жидкости из правого вздутия наружу, к колонке. Эту жидкость будет выдавливать средний ролик, катящийся вправо. Левый ролик, двигаясь за средним будет перемещать левое вздутие вправо, по направлению к выходу. Тем временем в левое положение будет подходить сверху следующий ролик. Он замкнет новое вздутие, восстанавливая изображенную на рисунке картину.

Благодаря винту регулировочную пластину можно отодвинуть от роликов так, чтобы она обеспечивала пережатие сменной, более толстой резиновой трубки. Так осуществляется переход на новый диапазон больших скоростей подачи жидкости.

Легко вообразить себе не показанный на рисунке электромотор, вращающий ведущий диск. Обычно используют так называемые «шаговые» электромоторы. Их вращение определяется длительностью и частотой следования электрических импульсов, вырабатываемых встроенным в насос электронным генератором импульсов. Такие насосы отличаются очень тонкой регулировкой и постоянством скорости вращения.

Роликовые насосы любой конструкции имеют один общий недостаток — их ролики слегка проскальзывают по резиновой трубке и постепенно ее изнашивают.

На рис. 3 показана схема рабочей части перистальтического насоса планетарного типа. То, что принцип его работы таков же, как описано выше, бросается в глаза сразу. Отличие состоит в том, что периферийные, рабочие ролики (которые даже не имеют осей) вращаются вокруг одного центрального ролика, связанного с электромотором.

Этот ролик силою трения заставляет вращаться все периферийные ролики так, что они без всякого скольжения катятся по резиновой трубке. (Степень их прижатия к резине и здесь регулируется винтом.) Однако в этой системе длительная эксплуатация прибора тоже приводит к износу. Но не резины, а самих роликов, изготавливаемых из тефлона. Что нарушает их сцепление с центральным роликом.

Создание градиента концентрации CsCI

Отмеченная ранее малая вязкость солевых растворов имеет ту оборотную сторону, что она не позволяет заранее (как это делают для растворов сахарозы) создавать в центрифужной пробирке градиент концентрации соли. Этот градиент очень быстро будет разрушен за счет диффузии ионов соли. Зато, ввиду тяжести молекулы CsCI, при длительном и неизменном по скорости вращении первоначально однородного раствора соли устанавливается динамическое равновесие между седиментацией самих молекул соли и их диффузией. В результате образуется (в ходе самого центрифугирования!) некий, нелинейный градиент концентрации CsCI, a следовательно, и плотности его раствора по высоте пробирки. Вполне пригодный для фракционирования биологических макромолекул или частиц по их плавучей плотности.

Установление градиента плотности раствора CsCI в ходе центрифугирования — процесс долгий. Он занимает, как минимум, 60—70 часов. Его можно несколько ускорить, если предварительно заполнить пробирку тремя равными порциями растворов CsCI различной плотности: средней для среднего слоя заполненной пробирки и, соответственно, увеличенной или уменьшенной на половину от величины различия плотностей, которые ожидают получить для жидкой среды центрифугирования у дна пробирки и на ее мениске.

С этой же целью равновесное ультрацентрифугирование проводят иногда в угловых роторах. Распределение плотностей раствора CsCI во время центрифугирования идет все равно в направлении радиуса вращения, но значительно быстрее, поскольку в этом направлении наклонно стоящая пробирка намного короче (см. рис. 48а). На том же рисунке условно-дискретными зонами показано расположение слоев различной плотности CsCI к концу центрифугирования (различная штриховка) и находящиеся

Рис. 48

между ними полосы разделившихся частиц (жирными линиями на рис. 486). Положение этих зон и полос в пробирке, извлеченной из ротора по окончании центрифугирования показано на рис. 48 в. В течение некоторого времени, пока диффузия не размоет эту картину, раздельное положение полос вещества сохраняется.

В качестве примера приведу результат очистки равновесным центрифугированием плазмид от примеси основной массы ДНК бактерии (Currier, Nester, 1976). Основную массу ДНК бактерии — хозяина удаляли денатурацией при рН12,2 и переводом ее в фенольную интерфазу в присутствии 0,5 М NaCI (см. гл. 3, § 2). Плазмидная ДНК оставалась в водной фазе, где она легко ренатурируется. Дальнейшую ее очистку вели равновесным центрифугированием в CsCI с добавлением бромистого этидия для окраски полос. Использовали 48% -ный раствор CsCI, чему соответствовала его начальная плотность 1,55 г/см³. (Столь малое значение этой плотности обусловлено уменьшением плавучей плотности ДНК обоих типов за счет связи с красителем.) Центрифугировали при температуре 14°С в угловом роторе (Spinco-40) при 35 000 об/мин в течение 60 часов. На графике рис. 49 показано надежное отделение ДНК плазмид (пик 1) от остатков основной ДНК бактерии (пик 2).

Литература

1. Музя Г.И., Куликов В.И., Ванько Л.В., Сухих Г.Т. Роль фосфолипидного фактора активации тромбоцитов в репродукции // Акушерство и гинекология -1996. -3. -С.12-16.

2. Музя Г.И., Орлов С.М., Бердышев Е.В., Куликов В.И. Взаимодействие 1-О-алкил-2-метокси-sn-глицеро-3-фосфохолина и фактора активации тромбоцитов с клетками крови и опухолевыми клетками // Биохимия.-1994.-Т. 56.-С.-1054-1061.

3. Мысляева Т.Г. Динамика электролитов в процессе обезвоживания организма. Всесоюзная конференция. - Ленинград.1978.