Психофизиология человека Кроль В М (стр. 25 из 61)

Перед проведением экспериментов с избеганием горьких бусинок цыплятам вводят в кровь 2-дГ; через полчаса после эксперимента цыплят забивают, мозг замораживаю^, с помощью микротома делают тонкие срезы, каждый из которых наносят на предметное стекло и покрывают листком рентгеновской пленки, фиксирующей места концентрации 2-дГ в виде точечных потемнений.

Дальнейшее исследование может проводиться только с этими небольшими по объему (порядка 2 мг) областями. Для того чтобы понимать стратегию этих работ, по-видимому, необходимо кратко пояснить методы, с помощью которых изучают временное развитие формирования следов памяти. В противном случае у психолога, не имеющего представления о принципах нейрохимических исследований, может сформироваться комплекс «нейрохимической неполноценности» — глубоко ошибочное представление о невозможности разобраться в столь сложных для непосвященных материях либо может появиться неоправданная вера в неограниченные возможности нейрохимии. И то и другое, естественно, вредно для исследований.

Проследить, только глядя в микроскоп, поэтапные изменения в процессе обучения, понять нейрохимию процессов обучения и запоминания никак невозможно. Поэтому в биохимии используются принципиально другие подходы. Во-первых, существуют подходы, связанные с использованием радиоактивной метки, когда активация синтеза вещества измеряется по включению радиоактивного компонента в течение какого-то интервала времени. Другая группа методов связана с многоэтапным разделением отдельных фракций клеток на основании разницы их молекулярных характеристик, например молекулярного веса, электрического заряда молекул, трехмерной структуры молекул и т. д. Основными среди этой группы являются имеющие множество модификаций методы центрифугирования и столь же разнообразные методы гель-электрофореза.

Подобно тому как при центрифугировании молока на масло, сметану и другие фракции, в процессе центрифугирования и ультрацентрифугирования содержимого клеток могут быть выделены фракции синап-тических структур мембран, структур ядра с находящимся в нем генетическим материалом и т. д. В зависимости от молекулярного веса и размера эти фракции располагаются в виде компактных полос в пробирках, заложенных в центрифугу. В дальнейшем содержимое полос может быть идентифицировано путем многочисленных и разнообразных методов обработки, окраски, радиоактивного анализа и т. д.

В частности, в качестве дальнейшей обработки отдельные фракции белков часто подвергают еще более тонкому фракционированию при помощи методов электрофореза. Бытовым прототипом этих методов является процесс «расползания» пятна по ткани, что особенно видно при попытках замывания пятна. При использовании электрофореза капля анализируемой фракции помещается на полосу фильтровальной бумаги или, что более удобно, на студенистый гель, и с помощью растворителей или электрического тока производится «разгонка» компонентов. Разные молекулы в зависимости от их родства с растворителем или в зависимости от собственного заряда имеют разную скорость, причем эта скорость является очень точной индивидуальной характеристикой каждого типа молекул.

В современной практике часто используют двумерный гель-электрофорез, когда вначале анализируемую фракцию подвергают разгонке в одном направлении (скажем, слева — направо), например, под воздействием тока, а затем — в противоположном (сверху — вниз), например, под воздействием растворителя. В результате после соответствующей окраски получается двумерная карта, покрытая пятнами, содержащими разные типы молекул. На рис. 4.1 приведен пример двумерного гель-электрофореза белков бактериальной клетки. За один раз при использовании методов двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2000 отдельных белковых цепей. Причем разрешающая способность метода настолько велика, что в некоторых случаях позволяет разделить два белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой.

Далее, ввиду того что раз от раза скопления одних и точно таких же белковых цепей располагаются точно в тех же местах, отдельные пятна можно вырезать из геля скальпелем или бритвой, накапливать и подвергать дальнейшему анализу. Точность расположения пятен настолько велика, что их идентификация может быть осуществлена с помощью сравнения экспериментальных данных, рассматриваемых в качестве кандидатов на идентификацию, и данных с «разгонкой» капли, составленной из известных белковых цепей. Условием такого подхода, конечно, является точное соблюдение условий гель-электрофореза.

В результате использования таких методических приемов в рамках описанной поведенческой модели (избегание клевания горьких бусинок у цыплят) удалось проследить временной ход некоторых процессов формирования следа памяти. При использовании методов радиоактивного мечения было показано, что спустя 30 минут после клевания горькой бусинки достигает пика процесс фосфорилирования определенных белков пресинаптической мембраны. (В подобных экспериментах обычно используется какой-либо предшественник, содержащий радиоактивную метку. В данном случае использовалась меченая фосфором аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), молекулы которой представляют собой основные аккумуляторы энергии живой клетки.)

В общем виде схема обучения и запоминания выглядит следующим образом. Клевание горькой бусинки запускает у цыпленка каскад биохимических процессов. Нейромедиатор, в данном случае глутамат, выделяется из пресинаптических аксонных окончаний, проходит через синаптическую щель, соединяется со специализированными рецепторами. Затем в результате формирования комплекса «рецептор — нейромедиатор» происходят различные, до конца не выясненные процессы, в частности связанные с работой внутриклеточных посредников (Са²⁺, цАМФ) и протеинкиназ, фосфорилирующих определенные белки.

По ряду гипотез Са²* и (или) протеинкиназы играют в процессах обучения и запоминания принципиально важную роль — являются сигналами для активации групп генов клеточной ДНК (Роуз С, 1995, Психофизиология, 2001). Таким образом, эти гипотезы предполагают включение в процесс формирования следа долговременной памяти генетического аппарата организма. В результате активации генов включается стандартный путь наработки белковых и гликопротеино-вых молекул, являющихся важной частью синаптических мембран. (Гликопротеиновые молекулы включают в свой состав, кроме белковой части, остатки Сахаров, например глюкозы.) Эти молекулы транспортируются к мембране, включаются в нее, и таким образом, в конечном счете, происходит изменение формы и размеров пре- и постсинаптиче-ских структур (рис. 4.2), По данным (Роуз С, 1995), через 24 часа после обучения в активных зонах число постсинаптических шипиков на

дендритах увеличивается на 60 %. Форма шипика при этом изменяется — «кончик каждого из них раздувался словно маленький воздушный шарик». Кроме того, имело место увеличение числа синапсов и длины постсинаптических мембранных утолщений.

Роль «ранних» и «поздних» генов в процессах формирования следов индивидуальной памяти

Спрашивается, в какой мере предположения об участии групп генов в формировании следов индивидуальной памяти подтверждаются экспериментально и в чем конкретно заключается роль генетического аппарата? Общие теоретические предпосылки участия генетического аппарата в процессах формирования следов индивидуальной памяти вытекают из понимания того, что изменения формы и размеров мембранных структур должны быть неизбежно связаны с процессами наработки белковых и гликопротеиновых молекул, составляющих основу мембран. Другими словами, факт роста синаптических образований требует включения в процесс генов, управляющих наработкой этих молекул.

Общее направление экспериментов, свидетельствующих о роли генетического аппарата, заключается в определении корреляции между активностью тех или иных групп генов и процессами обучения и запоминания. Действительно, в рамках модели «отказа от клевания горькой бусинки» было показано, что в пределах получаса после обучения и примерно в то же время, когда было фиксировано активное включение меченой глюкозы и повышение фосфорилирования мембранных белков, имело место резкое возрастание активности так называемых ранних генов клеточного ядра. Далее, через несколько часов происходит активация других, так называемых поздних генов, управляющих синтезом белков и гликопротеинов пре- и постсинаптических мембран (рис. 4.3).

На рис. 4.3 также показана выраженность эффекта пульсирующих вспышек электрической активности нейронов, расположенных в тех областях мозга цыплят, которые связаны с обучением распознаванию. Эта активность в виде пачек потенциалов действия была выражена только у тех цыплят, которые хорошо помнили уроки избегания: амплитуда вспышек у обученных цыплят превышала в несколько раз фоновую активность контрольных цыплят, и вспышки отсутствовали у цыплят, подвергавшихся амнезии в результате воздействия электрошока. Картина пульсирующей активности, по мнению автора, аналогична эфоректам долговременной потенциации, описанным в главе 6.

Обнаружение фактов активации «ранних» и «поздних» генов и выявление сущности процессов, управляемых этими генами, привело некоторых исследователей к формулированию гипотезы общности последовательности молекулярных процессов экспрессии генов в процессах эмбрионального развития организма и в процессах формирования индивидуальна, не передающихся по наследству следов памяти при обучении. Основанием для -таких предположений служат данные о том, что в тех и других случаях происходят процессы пластических изменений формы и размеров отдельных клеток и их частей. Действительно, как было показано в работах по изучению онтогенетического развития эмбриональных тканей, активированные протеинкиназы, находящиеся в мембране или внутри клетки, например С-киназы, проникают при определенных условиях в ядро клетки и вызывают экспрессию (включают и активируют) «ранних» генов.