Криоконсервации спермы русского осетра и севрюги (стр. 7 из 9)
3.1. Оценка качества нативной спермы
Русский осетр. Нативную сперму русского осетра получили от 9 самцов путем сцеживания. Результаты оценки качества представлены в табл. 1
Таблица 1.
Оценка качества нативной спермы русского осетра.
| № самца | % подвижности | Время жизни |
| 1 | 100 | 3.47 |
| 2 | 100 | 4.30 |
| 3 | 100 | 5,30 |
| 4 | 100 | 6,53 |
| 5 | 100 | 4.40 |
| 6. | 100 | 6.39 |
| 7 | 100 | 3.37 |
| 8 | 100 | 3.14 |
| 9 | 100 | 7.27 |
| Уср. | 100 | 4.9 |
Примечание: N = 9. М = 4.9, . m = ±0.42.
После статистической обработки вариационного ряда оказалось, что по своим показателям сперма от разных самцов русского осетра достоверно не отличается друг от друга, Ошибка измерения составила m = ±0.42, что свидетельствует о незначительном разбросе показателей. Последнее свидетельствует , что можно замораживать сперму всех самцов. В среднем количество подвижных спермиев составило 100% во всех пробах, среднее время их жизни – 4.9 минуты, что соответствует рыбоводным нормативам (3 минуты). Для глубокой заморозки отобраны пробы самцов №№ 1- 6.
Севрюга. Получена сперма от 6-ти самцов. Седьмая проба состояла из смеси спермы от разных производителей. Результаты оценки качества приведены в таблице 2.
После статистической обработки вариационных рядов оказалось, что сперма севрюги от разных самцов достоверно отличается друг от друга. Поэтому криоконсервации отобраны образца спермы от самцов №№ 1, 3, 4, 6.
Таблица 2.
Оценка качества нативной спермы севрюги .
| № самца | % подвижности. | Время жизни |
| 1 | 100 | 13.5 |
| 2 | 0 | 0 |
| 3 | 100 | 7.55 |
| 4 | 80 | 7.03 |
| 5 | 0 | 0 |
| 6 | 30 | 5.31 |
| 7 | 10 | 2.45 |
| Уср. | 45.7 | 5.11 |
Примечание: N = 7. % подвижности: М = 45.7, m = ±2.59,
время жизни: М = 5.11, m = ±0.86.
Впоследствии была получена сперма от самцов севрюги №№ с 9 по 19. Их оценка качества представлена в таблице 3.
Таблица 3.
Оценка качества нативной спермы севрюги.
| № самца | % подвижности. | Время жизни |
| 8 | 100 | 2.52 |
| 9 | 60 | 1.43 |
| 10 | 100 | 3.35 |
| 11 | 80 | 1.29 |
| 12 | 60 | 1.20 |
| 13-18 | 0 | 0 |
| 19 | 50 | 1.36 |
| Уср. | 64.3 | 1.6 |
Примечание: N = 7. % подвижности М = 64.3, m = ±1.9
время жизни М = 1.6, m = ±0.4.
После статистической обработки данных и их анализа установлено, что этот материал не пригоден для глубокой заморозки в жидком азоте, так как в основной массе по всем показателям данный материал не отвечает рыбоводным показателям. Если же принять во внимание ожидаемое ухудшение качества спермы по принятым показателям (% подвижных сперматозоидов и время жизни спермиев), то после температурного шока (криоконсервации) такая сперма вряд ли может демонстрировать положительные свойства при оплодотворении. Поэтому принято решение данный биологический материал исключить из эксперимента.
3.2. Подбор оптимальных концентраций составляющих протекторов
Русский осетр. В качестве основных составляющих криопротекторы веществ являлись: глицерин, ДМСО, гепарин, сахароза, яичный желток и манит. За основной показатель для оценки концентрации апробируемых веществ принимали временя жизни сперматозоидов. Результаты тестирования приведены в табл. 4.
Таблица 4.
Результаты установления концентраций.
| С | Глицерин | ДМСО | Гепарин |
| 0.1мг/0.5мл³ | 0 | 0.46 | 2.09 |
| 0.05мл 3. | 2.01 | 0 | 3.10 |
| 0.025 мл 3. | - | 2.02 | - |
| 0.025Х 3 | Смесь 2.26 | ||
Для русского осетра были отобраны ряд вариантов криопротекторов, отличающихся друг от друга составом криопротектора №№ 1. 2. 3 и 4 и режимом заморозки-разморозки. Их различия были зашифрованы под следующими обозначениями: ОТ, БОТ, АБ и АС.
Для реализации эксперимента был использован однофакторный блочный тип планирования эксперимента (Адлер, 1969), где за блоки принимали сперму от разных самцов, а за факторы – варианты криопротекторов и режимы криоконсервации. За выходные показатели выбрали как время жизни сперматозоидов, так и % живых спермиев в опыте и контроле. Результаты эксперимента приведены в таблицах 5 – 8.
Таблица 5.
Однофакторный блочный эксперимент (% живых сперимев)
| Блоки | ОТ | БОТ. | А.Б. | АС | 1 | 2 | 3 | 4 | К | Tj |
| 1 | 23 | 0 | 0 | 2 | 6 | 10 | 7.5 | 15 | 100 | 163.5 |
| 2 | 2 | 0 | 2 | 5 | 7.5 | 12.5 | 5 | 7.5 | 100 | 141.5 |
| 3 | 2 | 0 | 0 | 5 | 17.5 | 32.5 | 10 | 5 | 100 | 158 |
| 4 | 5 | 5 | 3 | 5 | 5 | 15 | 10 | 17.5 | 100 | 165.5 |
| 5 | 60 | 20 | 5 | 5 | 15 | 10 | 12.5 | 5 | 100 | 232.5 |
| 6 | 10 | 5 | 0 | 3 | 10 | 10 | 10 | 5 | 100 | 153 |
| Ti | 102 | 30 | 10 | 25 | 61 | 90 | 55 | 55 | 600 | 1028 |
Статистическая обработка результатов
Корректирующий член Т ״ ²/ N = 1028/54 = 19570, где N = 54.
SS общ. = ∑∑ yi ² - T ײ ²/ N = 69250 – 19570 = 49680.
SS фак. = ∑ Ti ²/ n - К.Ч. = 43322 – 19570 = 23742, где n = 9.
SS бл. = ∑ Ti ²/ k - К.Ч. = 9859.
Ss ош. = 49680 – (23742 + 9859) = 16079
Таблица 6.
Дисперсионный анализ
| Различия | Степени свободы | Сумма квадратов | Средний квадрат |
| Между факт. | 8 | 23742 | 2967 |
| Между бл. | 5 | 9859 | 1971 |
| Ошибка | 64 | 16079 | 251 |
F кр. Факторы = 2967 / 7750 = 11.8.
Fкр.бл. = 1971 / 7750 = 7.8
Таблица 7.
Однофакторный блочный эксперимент (время жизни спермы)
| Бло ки | К | 1 | 2 | 3 | 4 | .ОТ | БОТ | АБ | АС | Tj |
| 1 | 3.4 | 4.6 | 3.5 | 2.8 | 4.4 | 1 | 0 | 0 | 2.1 | 21.8 |
| 2 | 4.3 | 5.3 | 3.4 | 4.1 | 4.6 | 0.3 | 0 | 2.5 | 9.2 | 33.7 |
| 3 | 5.3 | 7.9 | 5.4 | 7.2 | 2.5 | 0.3 | 0 | 0 | 6.4 | 35 |
| 4 | 6.5 | 1.3 | 3.4 | 6.1 | 1.9 | 1.1 | 2.2 | 4.1 | 5.3 | 31.9 |
| 5 | 4.4 | 8.4 | 5.5 | 8.9 | 3.1 | 6.5 | 2 | 3.1 | 6.4 | 48.3 |
| 6 | 6.4 | 5.2 | 4.2 | 5.5 | 3.6 | 3.5 | 2.6 | 0 | 3.5 | 34.5 |
| Ti | 33 | 32.7 | 25.4 | 34.6 | 20.1 | 12.7 | 6.8 | 9.7 | 32.9 | 207.9 |
N = 54. n = 9. k = 6
Статистическая обработка результатов
К.Ч. T ״ ²/ N = 800.4
SS общ. = 2989.5 – 800.4 = 2189.1
SS факт = 5630.3 : 9 – 800.4 = 625.6 – 800.4 = - 174.8
SS бл. = 1229.4 – 800.4 = 429.
SS ош. = 2189.1 – (-174.8 + 429) = 1934.9
Таблица 8.
Дисперсионный анализ
| Различия | Степени свободы | Сумма квадратов | Средний квадрат |
| Между факторами | 8 | 174.8 | 21.9 |
| Между блоками | 5 | 429 | 85.8 |
| Ошибка | 64 | 1934.9 | 30.2 |
F кр. факторы. = 0.7; F кр. блоки = 2.8.
Из результатов дисперсионного анализа по времени жизни спермиев после дефростации видно, что между протекторами нет значимых различий при значимости последних между блоками, т.е. все протекторы «работают» одинаково.
По полученным коэффициентам регрессии Ti по обоим видам оценки качества биологических проб были составлены ранжированные ряды (рис. 5, 6).
Рис. 5. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (% живых спермиев).
Анализ ранжированных рядов свидетельствует о том, что состав криопротекторов имеет более существенное значение для сохранения жизнеспособности клеток при глубоком замораживании чем режимы заморозки-оттаивания.
Процент подвижных спермиев как показатель качества оказался менее объективным, чем время жизни клеток этого типа, так как в сравнительно короткие сроки достоверно установить величину этого показателя довольно сложно. Для получения надежных данных необходим достаточный опыт работы. Поэтому в дальнейших исследованиях принимается решение использовать его лишь как косвенные данные, пригодные для дальнейших расчетов количества дефростированной спермы при оплодотворении получаемых объемов икры.
Рис. 6. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (время жизни спермиев).
Состав криопротектора № 3 по времени жизни сперматозоидов русского осетра оказался выше остальных, исследуемых в данном эксперименте.
Севрюга. В качестве контроля использовали нативную сперму (табл. 2; средне время жизни 5.11 мин., % подвижных сперимев – 45,7%). В качестве факторов использовали составы протекторов №№ 1-4. Протектор № 5 представлял собой раствор глицерина в концентрации, принятой для холоднокровных животных. Эксперимент по установлению оптимальных составов криопротекторов спланирован по типу однофакторного блочного. За факторы принимали различные составы криопротекторов, за блоки - сперму от отдельных самцов. Эксперимент реализовали в двух повторностях, что позволило существенно снизить общую ошибку. За выходные показатели взяты время жизни спермиев и процент подвижности сперматозоидов в пробе. Результаты обработаны как отдельные выборки. Последние представлены в таблицах 9 – 12.