Криоконсервации спермы русского осетра и севрюги (стр. 6 из 9)

3) мышиных зародышей, хранившихся в жидком азоте, в течение 13 лет облучали при мощности дозы, в 100 раз превышающее уровень фона. После этого зародыши были разморожены и пересажены в матки самок – «приемных матерей». Родившиеся мышата были нормальными по жизнеспособности и плодовитости и число мутаций, проявившихся у их потомков, не отличались от контроля. Таким образом, существующие на сегодня данные, как экспериментальные, так и полученные путем теоретических расчетов, показывают, что допустимое время хранения половых клеток в глубокозамороженном состоянии без существенного повреждения их организма при существующем на сегодня на Земле радиоактивном фоне составляет не менее 20О лет. Возможно, что в действительности оно много больше ( Somme , 1982).

Тепловые мутации, то есть мутации, при температуре жидкого азота практически не возникают. Иначе бы не было радиоактивного фона, то клетки в азоте можно было бы хранить практически вечно ( O Neil , Mac Neill , 1993).

До сих пор экспериментально не выяснена в достаточной степени возможность возникновения мутаций в ходе самого процесса замораживания и оттаивания клеток. Нет также данных о преимущественном отборе каких-либо генотипов при замораживании популяции однотипных клеток (Бергман, Найденко, 1992).

Возможно, перспективным окажется при длительных сроках хранения генов использование специальных веществ, замедляющих в случае невозможности глубокого замораживания такие образцы могут быть фиксированы спиртом или феноксиэтанолом, не разрушает химическую структуру ДНК (Вепринцев, Ротт, 1984)

1.4.8. Способы получения живых животных из замороженных спермиев

Как известно, развитие всех живых организмов, размножающихся половым путем, начинается слиянием мужской и женской половых клеток. Однако существуют, по крайней мере, два пути воссоздания вида, от которого сохранились только замороженные спермин.

Первый путь - оплодотворение такими спермиями яйцеклетки самки другого вида, то есть межвидовая гибридизация (Алтухов, 1989).

Очевидно, что невозможность скрещивания с другими видами - необходимое условие существования вида как такового. Однако эта невозможность может обеспечиваться различными путями. Во-первых, виды могут не скрещиваться просто в силу их пространственной изоляции. В таком случае, оказавшись в одном месте, виды могут образовать гибриды. Скрещиванием белуги со стерлядью была получена новая форма - бестер, имеющая значение при товарном выращивании (Алтухов, 1989).

Большую сложность представляют случаи, когда наблюдается так называемая физиологическая изоляция вида, то есть неспособность его к скрещиванию с другими видами. Такая изоляция может быть вызвана раз-личными причинами. Одна из наиболее преодолимых - это различия в поведенческих реакциях. В таком случае достаточно применить искусственное осеменение самок. Сложнее случай, когда спермин оказываются нежизнеспособными в половых путях самки другого вида. Способ преодоления этого препятствия - разработка методов оплодотворения яйцеклетки в пробирке. Этот этап представляет значительные трудности, так как перед проникновением в цитоплазму яйца спермий претерпевает ряд физиологических и морфологических изменений, связанных с взаимодействием спермия с наружными оболочками яйцеклетки, или со средой половых путей самки. Для имитации этих взаимодействий оплодотворение приходится производить в специально подобранных средах. Для 14 видов млекопитающих удалось подобрать такие среды, в которых осуществляется проникновение спермия в цитоплазму яйцеклетки. У 4 видов после введения таких оплодотворенных яйцеклеток в матку самки они развивались до рождения детенышей. Большое внимание привлекли работы с оплодотворением в пробирке яйцеклеток человека (Вепринцев, Ротт, 1984).

Таким образом, анализ литературы по криоконсервации показывает, что в данном направлении достигнуты довольно значительные результаты, однако ряд вопросов, связанных с замораживанием и оттаиванием спермиев рыб и других животных остается не выясненным. Так актуальным остается вопрос об видоспецифичности криопротекторов для разных видов осетровых. В месте с тем, до конца не установлено качество спермы, пригодной для криоконсервации.

Исходя из выше сказанного и анализа литературных источников целью данной работы явилось разрешение следующих задач:

1. Оценить качество спермы от разных самцов русского осетра и севрюги. Для замораживания отобрать сперму только высокого качества, отвечающую рыбоводным показателям.

2. Установить адекватность принятых оценок – время жизни и процент подвижных спермиев в биологической пробе на разных этапах замораживания-оттаивания (нативная сперма, сперма после дефростации, сперма после оттаивания).

3. Оценить роль каждого вещества в составе многокомпонентного криопротектора.

4. Выявить оптимальные составы криопротекторов для спермы русского осетра и севрюги.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа проведена в период май-июль месяцы 2006 года на Александровской осетровом рыбоводном заводе Севкаспрыбвода.

Количество проведенных опытов по подготовке и реализации исследо-ваний представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Объем экспериментального материала.

№ п/п	Наименование работ	Всего Опытов
1.	Оценка качества нативной спермы русского осетра	35
2.	Оценка качества нативной спермы севрюги	35
3.	Подбор концентраций компонентов криопротектора	20
4.	Сравнение протекторов на сперме русского осетра (время жизни)	120
5.	Сравнение протекторов на сперме русского осетра (% подвижных спермиев)	120
6.	Сравнение протекторов на сперме севрюги (время жизни)	120
7.	Сравнение протекторов на сперме севрюги (% подвижных спермиев)	120
Всего опытов		570

Сперму от самцов русского осетра и севрюги отбирали методом сцеживания. Ее до замораживания хранили в холодильнике при t = +4°С. Время хранения от 1.5 часов до 2 суток.

Перед замораживанием сперму первоначально смешивали с одним из образцов криопротектора, затем смесь оставляли на эквилибрацию (до 40 минут) при комнатной температуре. После этого образцы раскапывали в пробирки Эпендорфа и начинали замораживание в парах жидкого азота. Для этого замаркированные пробирки помещали на площадку, которая находилась в емкости с жидким азотом и «плавала» на его поверхности (рис. 1). Температура на поверхности пластины – -70 - -100°С. Время выдерживания образца в парах жидкого азота устанавливали экспериментально, после чего последний погружали в жидкий азот ( t = -196°С). Вместе с тем апробировали способ сверхбыстрой заморозки спермы на тефлоновом планшете (рис. 3), которую помещали на поверхность жидкого азота в кювету. Сперму автоматическими пипетками раскапывали по гнездам пластины. Замороженные шарики ссыпали в емкость, объемом до 20 мл., которую помещали в жидкий азот.

Для проведения исследований влияния скоростей замораживания на качество и жизнестойкость образцов было необходимо осуществить калибровку температур в опытной камере. Рофиль распределения температур в зависимости от расстояния до поверхности жидкого азота приведен на рис. 2.

1

2

4

3

2

Рис. 1 Установка для замораживания образцов.

1 – емкость. 2 – жидкий азот. 3 – пенопластовая пластина на поверхности жидкого азота. 4 – замораживаемый образец.

Рис. 2. Профиль температуры в экспериментальной установке.

Размораживание образца осуществляли следующим образом. Быстрый вариант. Образец помещали под водяную баню, где температуру среды поддерживали 36-38°С. После оттаивания (время от 2 до 4 минут) замороженный образец помещали в базовый раствор для отмывки от криопротектора. Время отмывки для каждого вида осетровых рыб устанавливали отдельно.

Рис. 3. Планшет для быстрой заморозки образцов.

Рис. 4. Установка для замораживания спермы осетровых рыб.

За выходные показатели в экспериментах принимали время жизни сперматозоидов после оттаивания и отмывки протектора до полной их остановки, а также % подвижных спермиев в зоне видимости микроскопа. Третьим показателем являлся процент оплодотворения икры дефростированной спермой.

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением приемов Теории планирования экспериментов. Использован план однофакторного блочного эксперимента с дисперсионным анализом. За факторы принимали образца криопротекторов, за блоки – сперму от разных самцов. Значимость различий между факторами и блоками устанавливали с применением F -критерия Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Перед началом эксперимента было необходимо проверить ряд параметров факторов. К таковым в первую очередь относятся: возможность криоконсервации спермы осетровых рыб любого качества и установление концентраций компонентов криопротекторов.