Пока не удалось создать универсального метода замораживания сперматозоидов для различных видов. Наибольшее практическое значение метод замораживания сперматозоидов получил в разведении крупного рогатого скота. В развитых странах более 90% коров осеменяют спермой, хранившейся в замороженном виде. Замораживание спермы - один из самых результативных на сегодняшний день путей создания банка генов исчезающих пород скота. Такие банки созданы уже в ряде стран. В скандинавских странах они существуют с 70-х годов, в Польше созданы в 1981г. В России генофондное хранилище замороженного се мени быков местных пород существует при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики животных под Ленинградом. Широкому внедрению метода в другие отрасли животноводства препятствует его недостаточная разработанность применительно к другим видам (Белоус и др., 1987).
В отношении исчезающих видов животных следует иметь в виду еще один путь сохранения мужских половых клеток - замораживание Семенников погибших в зоопарках или питомниках животных с последующей имплантацией их кастрированным самцам. Такие опыты были проведены на птицах советскими исследователями Б.Г.Новиковым и Л.И.Любарской, которые показали, что спустя несколько недель в пересаженных после оттаивания семенниках происходило образование зрелых сперматозоидов. Конечно, для целей сохранения исчезающих видов имеет смысл производить пересадки семенников исчезающего вида самцам обычных видов, то есть межвидовые пересадки (Вуд и др., 1990).
Этот метод значительно более труден и поэтому менее разработан, чем метод замораживания сперматозоидов. Яйцеклетки легко повреждаются при замораживании, в первую очередь, по-видимому, из-за их значительно больших размеров по сравнению со спермиями, рыхлой структурой ядерного аппарата и значительно большим содержанием воды. Пока удалось осуществить оплодотворение замороженных и оттаянных яйцеклеток у мышей, крыс и хомяков, а развитие до рождения оплодотворенной после оттаивания яйцеклетки наблюдали только у мышей. Более перспективным может оказаться замораживание яичников, в которых имеются» наряду с крупными, также и мелкие половые клетки, более успешно выдерживающие замораживание. После оттаивания такие яичники имплантируют кастрированной самке, и половые клетки завершают свое развитие, Такие опыты были успешно проведены на мышах и крысах. Однако в этих случаях замороженные и оттаянные яичники имплантировали самке того же вида. Между тем возможна такая ситуация, при которой последняя самка исчезающего вида погибнет, и от нее сохранятся только замороженные яичники, В этой связи большой интерес представляют опыты по межвидовой пересадке яичников проведенные на дрозофиле, хвостатых амфибиях и птицах. Во всех случаях яичники, пересаженные от одного вида животного к другому, были способны образовать яйца, из которых развивались зародыши того вида, от которого был взят яичник (Вепринцев, Ротт, 1984).
Замораживание зародышей было впервые проведено в 1971 г. на мышах. После оттаивания зародышей имплантировали в матку «приемной матери», где они продолжали свое развитие. К настоящему времени удалось разработать методику замораживания зародышей крупного рогатого скота, овец, коз, кроликов, крыс. У всех этих видов замороженные зародыши после оттаивания и трансплантации приемной матери продолжают успешно развиваться до рождения. Замораживание производится в присутствии криопротекторов – глицерина полиэтиленгликоля или диметилсульфоксида. У хомяков и свиней зародыши после замораживания и оттаивания зародыши остались живыми но до рождения их развитие не доходило. Удалось кратковременно сохранять замороженных зародышей трески, лососевых рыб морских ежей и кальмаров ( Grunina , Neifakh , 1997).
В нашей стране освоена методика замораживания зародышей лабораторных мышей, овец, кроликов и крупного рогатого скота. Метод замораживания зародышей имеет большое значение в практике сельского хозяйства, медицины и экспериментальных исследований. Во-первых, он позволяет сохранить генотип не только самцов, но и самок, выдающихся по своим хозяйственно-ценным признакам, и размножить их путем трансплантации зародышей приемным матерям. Во-вторых, он позволяет накопить большое количество однородного по возрасту и происхождению эмбриологического материала, что особенно важно при проведении биохимических исследований. В-третьих, он позволяет значительно упростить транспортировку сельскохозяйственных животных ценных пород и лабораторных животных. Ввоз замороженных зародышей - единственный способ импорта ценных пород и линий для тех стран, куда ввоз животных запрещен таможенными правилами, например в Австралию. Наконец, хранение замороженных зародышей позволяет получать детенышей в наиболее удобное время года (например, потомство от сельскохозяйственных животных – весной) (Межевикина, Каранова, 1995).
Длительное сохранение клеток в глубокозамороженном состоянии стало обычным методом для лабораторий, работающих с клеточными культурами. Обычно используют медленное замораживание со скоростью около 1°С в минуту и размораживание со скоростью 5-10°С в минуту, помещая ампулы с культурой в водяную баню при +37°С.В качестве криопротекторов используют глицерин. Практически удается заморозить клетки самых различных тканей (Ананьев, 1997).
Клеточные культуры - необходимый инструмент исследований, проводимых в биологии и медицине, а также биотехнологии. Они необходимы для получения вакцин и сывороток, поиска и проверки новых лекарственных препаратов, диагностики заболеваний производства физиологически активных соединений, в том числе интерферона - крайне активного антивирусного препарата ( Fahy , 1986).
Использование гибридных клеток дало возможность получать моноклинальные антитела, специфичные по отношению к определенному антигену. Это позволяет создавать иммунные антитела (сыворотки), не обладающие побочным действием (там же).
Всеми этими достижениями фундаментальная наука и биотехнология обязаны в значительной степени сохранению различных клеточных линий. Первая коллекция клеточных культур для нужд медицины и биологии была основана в США в 1925 г. В России научно-исследовательские институты различных ведомств имеют свои коллекции клеточных культур, в том числе сохраняемые в замороженном виде. В настоящее время в системе РАН создается Всесоюзная коллекция клеточных культур (Шпаро, 1983).
Сохранение в коллекциях глубокозамороженных соматических клеток различных животных может оказаться полезным не только для генной инженерии, но и для сохранения генетической информации об исчезающих видах животных, изучения их генетики (Карнаухов, 1994).
По прогнозам ученых, человечество достигнет «экологического равновесия» к началу X Х II в. Предполагается, что приблизительно через 120 лет можно будет выпустить в природу животных, как сохраненных в зоопарках, питомниках и фермах, так и восстановленных из замороженных клеток. Поэтому при использовании метода глубокого замораживания клеток, как способа сохранения генетической информации большое значение имеет вопрос о длительности сохранения замороженными клетками жизнеспособности и генетической неизменности (Вепринцев, Ротт, 1985).
Криоконсервация как метод сохранения половых клеток сельскохозяйственных животных для искусственного осеменения возникла в конце 40-х годов нашего столетия. Первоначально клетки пытались сохранять при температуре сухого льда, то есть -78°С, однако очень скоро выяснилось, что при этой температуре качество семени быстро ухудшается. При температурах ниже -130°С, то есть температуре, при которой уже не идет перекристаллизация льда, заметного ухудшения не возникает (Вепринцев, Ротт, 1985).
Поскольку сам метод глубокого замораживания существует сравнительно недавно, всего несколько десятков лет, нет достаточных экспериментальных данных для ответа на вопрос, как долго замороженные клетки сохраняют жизнеспособность и генетическую неизменность. Однако есть все основания надеяться, что значительная часть клеток при -196°С сохранит жизнеспособность в течение десятков и даже сотен лет. Существующая практика животноводства показывает, что потомство быков, семя которых хранилось в течение 25 лет в замороженном состоянии оказалось совершенно нормальным (там же).
При температуре -196°С практически не идут биохимические реакции. Однако клетки, в частности их геном, могут повреждаться за счет радиоактивного фона Земли и космического излучения. Радиоактивный фон Земли создается излучением радиоактивных веществ, существующих в природе и образующихся в результате атомных испытаний, атомной энергетики, излучения рентгеновской и изотопной аппаратуры, применяемой в медицине и промышленности. Суммарная мощность космического излучения и радиоактивного фона Земли мала: она не превышает 0,2 рад/г. Доза, при которой погибает 63% животных, составляет от 6ОО рад до нескольких тысяч, в зависимости от вида животного (Наук и др., 1991).
Расчеты времени, в течение которого можно быть уверенным в получении полноценного потомства из замороженных клеток, были проведены тремя независимыми способами:
1) анализ экспериментальных кривых летального действия ионизирующих излучений на клетки млекопитающих показал, что доза излучения, при которой выживает 37% половых клеток, при существующем уровне радиации при температуре -196°С может быть только за 200 лет. Эта оценка была сделана американским криобиологом Мазуром;
2) расчет числа повреждений, возникающих при хранении на фоне существующей радиоактивности, при ~196°С показал, что число невосстанавливаемых повреждений ДНК не превышает 10 при изменении в течение 300 лет на один геном половой клетки млекопитающих. Это существенно меньше числа повреждений, при которых гибнет 63% половых клеток;