Этапы получение лизина (стр. 2 из 3)

Обычно питательную среду готовят и стерилизуют в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизации среды состоит из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента лизина.

В производстве лизина используют мелассу, содержащую термолабильный компонент - сахарозу. Поэтому ее стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу, нагревают при постоянном перемешивании до температуры 80 °С, разбавляют водой согласно имеющейся рецептуре, затем быстро разогревают глухим паром до температуры 120-122 °С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели микрофлоры. Остальные компоненты среды смешивают также в реакторе с мешалкой и растворяют в воде с подогревом, нагревают в специальном аппарате до температуры стерилизации, выдерживаютпри этой температуре и охлаждают. Длительность, стерилизации при этом значительно меньше, но температура выше.

Пеногаситель часто стерилизуют отдельно, особенно в том случае, когда им является масло или жир. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.

Процесс получения лизина требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяют стерилизации не только среды, но а всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха. Режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлена аппаратура. Наиболее эффективна обработка аппаратуры и коммуникаций острым паром под давлением при температуре 135—140 °С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и для их обработки применяют "холодные" способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных в вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, β-пропиоллактон и т. д.). После холодной стерилизации остатки химических реагентов должны быть удалены промывкой стерильной водой.

Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций проверяют следующим образом. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате в течение суток. Если среды остаются стерильными, значит, стерилизация проведена правильно. Такой анализ проводят при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях.

Культивирование продуцента лизина в промышленных ферментаторах

Выращивание производственной культуры продуцента лизина осуществляется, как правило, периодическим способом в ферментаторах. В отличие от аппаратов, используемых при производстве кормовых дрожжей, ферментаторы имеют меньшие габаритные размеры и рассчитаны на 50, 63 и 100 м³. Все они предназначены для выращивания культуры в асептических условиях со строгим соблюдением герметизации процесса. Ферментаторы снабжают необходимыми коммуникациями, системой подачи стерильного пеногасителя, охлаждающими теплообменными устройствами и устройствами для перемешивания и введения в питательную среду стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, а также растворов кислот или щелочей для поддержания рН среды на заданном уровне. На рис. 2 представлен общий вид ферментатора для выращивания продуцента в асептических условиях

.

Рис. 2. Ферментатор вместимостью 50 м³:

1 — теплообменник; 2 — электродвигатель; 3 — привод мешалки; 4 — соединительная муфта вела; 5 — гильза для термометра; 6 — барботер; 7 — корпус аппарата; 8 — растяжка для центровки вале; 9 — лопасти мешалки; 10 — мешалка; 11 — опора аппарата

Стерильную среду в ферментатор вводят при температуре, близкой к температуре выращивания продуцента (32-35 °С), или около 80 °С. Во втором случае для окончательного охлаждения аппарата и среды используют теплообменные устройства самого ферментатора.

При достижении оптимальной температуры среды из посевного ферментатора подают посевной материал и тут же начинают аэрацию содержимого ферментатора. Коэффициент заполнения аппарата 0,65-0,75 в зависимости от степени ценообразования в данных условиях культивирования.

В ферментаторе устанавливают определенный режим культивирования в зависимости от особенностей продуцента. Для продуцентов лизина длительность ферментации составляет 58-72 ч.

В первые сутки микроорганизмы ассимилируют приблизительно 25 % общего азота среды, углеводов и почти все аминокислоты. За это время накапливается почти вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким замедлением накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина. Питательная среда сильно истощается, изменяется рН. На этой стадии целесообразно проводить подтитровывание среды 25 %-ным раствором аммиака или 15 %-ным раствором NaОН с целью стабилизации рН и дополнительно вводить питательные вещества (подпитка). Последняя стадия выращивания продуцента лизина характеризуется некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости накопления лизина.

Как отмечалось выше, на биосинтез лизина существенное влияние оказывают аэрация и перемешивание. Поэтому на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление лизина, аэрация, перемешивание и т. д.).

Для реализации процесса получения продукта микробиологического синтеза определяют времяначала подачи подпитки, а также изменения расходов растворов питательных ростовых веществ и стерильной воды, обеспечивающие максимизацию производительности аппарата. Например, после рассмотрения физиологической активности культуры Вгеvibacterium 22ЛД в периодическом процессе на питательной среде с ферментолизатом БВК при культивировании в ферментаторе объемом 100 м³ на Шебекинском биохимическом заводе для введения подпитки (40 %-ный раствор мелассы и 1,4 %-ный раствор солей) был выбран период с 12-го по 15-й ч культивирования, который характеризуется наибольшей скоростью лизинообразования. Подачей мелассной подпитки в питательную среду вводили 5-6 % сахаров. За 65 ч культивирования синтезировалось 47 г/л лизина. Выход лизина составлял 31 % по массе введенного сахара.

Готовая культуральная жидкость помимо лизина содержит биомассу продуцента, остатки непотребленных питательных веществ среды, продукты обмена веществ.

Выделение целевого продукта (L-лизина)

В зависимости от последующего назначения препарата можно на основе культуральной жидкости получить технические препараты в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (KKJI), а также кристаллический лизин. Для каждого из этих продуктов существует своя технология.

Для кормовых целей целесообразнее получать технические препараты ЖКЛ и ККЛ, так как они содержат помимо лизина значительное количество других важных для организма животного соединений, в частности витамины: рибофлавин, пантотеновую, фолиевую и никотиновую кислоты и др.

Технические препараты лизина получают на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы среды. Поскольку культуральная жидкость имеет сравнительно низкое содержание сухих веществ (10-13 %) и не обладает стабильностью при хранении, концентрацию сухих веществ увеличивают методом выпаривания или высушивания. Готовая культуральная жидкость перед концентрированием должна содержать минимальное количество редуцирующих сахаров, так как в процессе концентрирования они могут образовывать при участии ε-аминогруппы лизина соединения, не усваиваемые животными, т. е. происходит безвозвратная потеря целевого продукта.

Для стабилизации лизина культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до pH 5 и добавляют 25 %-ный раствор метабисульфита натрия в количестве 0,4 %. Далее стабилизированную культуральную жидкость выпаривают в вакуум-выпарной установке до концентрации сухих веществ 35-40 %. Потери лизина на этой операции составляют от 5 до 15 %. Вязкость ЖКЛ 0,648 ^. 10^-3 кг/(м ^.с), температура замерзания – 18 °С, удельная масса 1,150-1,300, pH 4,5-6.