Методы определения витаминов (стр. 2 из 3)
Хроматограмма анализа жирорастворимых витаминов:
1. Витамин А
2. токол
3. y -токоферол
4. a -токоферол (Витамин E)
5. лютеин
6. зеаксантин
7. криптоксантин
8. a -каротин
Несмотря на высокую чувствительность метода ВЭЖХ, высокая стоимость приборов, а также длительность анализа с учетом времени пробоподготовки существенно ограничивает его применение в аналитических лабораториях нашей страны.
3. Электрохимические методы определения витаминов
Электрохимические методы анализа широко используются в аналитической практике благодаря простоте, надежности, экспрессности, возможности определять практически все элементы периодической системы, разнообразные неорганические и органические соединения в широком диапазоне концентраций. Наибольшее развитие электрохимические методы получили в последние годы за счет использования электронной аппаратуры, компьютеров, разработке новых электродов и способов их очистки, позволяющих применять электрохимию на различных стадиях исследования. В настоящее время электрохимические методы анализа успешно применяются и для определения витаминов.
Публикации по определению витамина Е электрохимическими методами немногочисленны. Потенциометрическое и амперометрическое титрование хлорным золотом находит ограниченное применение из-за малой специфичности, т.к. хлорное золото не обладает способностью окислять эфиры токоферолов и другие производные. Для определения суммы токоферолов в их концентратах предложен метод амперометрического титрования в среде 1н. раствора серной кислоты в 75% этаноле раствором сульфата церия (IV) с помощью платинового электрода. Анализ токоферолов в этаноле и хлороформе с использованием ферроцианид иона в качестве медиатора проводили методом кулонометрии .
Также существует методика определения витамина Е в растительных маслах хронопотенциометрическим методом. Токоферолы окисляют при постоянном токе (4-10 мА) на стеклоуглеродном плоском дисковом электроде. Предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний, достигнутые при определении витамина этим методом, составили соответственно 15 мг/дм3 и 20 мг/дм3.
Потенциометрическое определение витамина В1 применяют в нескольких вариантах. Потенциометрическое титрование тиамина бромида проводят в 0,05 М AgNC>3 на индикаторном серебряном электроде. В фармпрепаратах тиамин титруют вольфрамовофосфорной кислотой с использованием графитового электрода.
В основе амперометрического метода определения тиамина лежит его реакция с метавольфрамовой кислотой. Измерения проводят при Е=-0,65 В анализаторе Гейровского.
Полярографический метод получил достаточно широкое распространение при анализе органических веществ. Основой, позволяющей делать заключение о структуре вещества, является форма и характер поляризационной кривой, а также величина потенциала полуволны, которая характеризует не только функциональную группу, но и ее положение в молекуле. Токоферолы являются полярографически активными, способны окисляться, образуя в области положительных потенциалов анодную волну. Известен способ определения токоферолацетата, основанный на получении одноэлектронной волны его анодного окисления (Е1/2-1,33 В, относительно нас.к.э.) в растворе ацетонитрила на фоне перхлората лития. о-Токоферол в этих условиях образует анодную волну при потенциале Е,/2=0,68 В. Определение витамина Е полярографированием на катоде возможно в виде его окисленной формы - токоферилхинона. Восстановление проводят в 75% этаноле на фоне ацетатного буферного раствора (рН 6-7).
Методика количественного полярографического определения токоферолов в маслах и жирах в виде токоферилхинонов основан на том, что анализ ведут на ртутном капельном электроде в среде ацетатного буферного раствора, содержащем 75 % этилового спирта (рН 7). Пробоподготовка включает омыление пробы 2 н. раствором КОН на кипящей водяной бане, экстракцию неомыляемой фракции сернокислым эфиром, растворение полученного экстракта в 96% этиловом спирте. После осаждения стеринов, токоферолы окисляют до токоферилхинонов раствором комплексной соли аммонийнитрата церия. Полярографический метод анализа витамина Е находит ограниченное применение в аналитической практике. Использование ртутного капельного электрода нежелательно по требованиям техники безопасности в испытательных химических лабораториях. Много внимания в литературе уделено полярографическому методу определения водорастворимых витаминов. Витамин В вызывает образование каталитических волн в аммиачном растворе кобальтовой соли, которые обусловлены раскрытием тиазолового цикла и образованием SH-формы тиамина. В щелочных средах при рН>9 тиамин образует анодную волну при Е]/2= -0,4В, которая соответствует образованию соединения SH-формы тиамина со ртутью. Определение витамина B1 в поливитаминных препаратах проводили на фоне 0,1 М KCI при Е=-1,25 В. Минимально определяемая концентрация витамина в этих условиях равна 2,0 мг/л [174, 216]. Методом производной полярографии тиамин анализировали в кислых буферных растворах. При рН 1,3 - 3,07 обнаруживается две волны, а при рН 3,07-4,92 только одна волна восстановления витамина. Переменнотоковая полярография применялась при исследовании хлористоводородной соли тиамина в буферных растворах с рН 3-10 [174].
4. Инверсионно вольтамперометрический метод определения водорасторимых витаминов B1 B2 в пищевых продуктах.
Витамины B1 /тиамин; 4-метил-5- β -оксиэтил-N-/2-метил-4-амино-5-метилпиримидил/-тиазолий бромид /или хлорид/ / и B2 /рибофлавин; 6,7-диметил-9-/ D -1-рибитил/-изоаллоксазин/ необходимы для нормальной жизнедеятельности организма. Они входят в состав сложных биокатализаторов, выполняющих различные функции в процессе обмена веществ. Важнейшие вещества такого рода активны физиологически в малых дозах и поступают в организм человека вместе с пищей.
Для вольтамперометрического анализа часто допустимы более простые методики предварительного выделения соединений, чем флуориметрические или хроматографические. Предварительная подготовка проб также может быть существенно уменьшена из-за возможности проведения вольтамперометрических измерений в мутных и окрашенных растворах как в водных, так и в неводных средах.
Проводится гидролиз связанных форм витаминов и белка, осаждение водорастворимого белка из гидролизата с последующим инверсионно-вольтамперометрическим определением витаминов. Новым в способе является то, что проводят кислотный гидролиз (0,15-0,20) M раствором H2SO4 или HCl на кипящей водяной бане в течение 30 40 минут, после охлаждения гидролизата проводят осаждение водорастворимого белка (0,4-0,5) г хлорида марганца 4-водным, затем 2-3 г хлорида калия с последующим инверсионно-вольтамперометрическим определением витаминов в безбелковом гидролизате путем регистрации катодных пиков витамина B1 при потенциалах (0,35-0,48)B (Eэ -0,15 B), анодных пиков витамина B2 в диапазоне потенциалов (0,15-0,20)B и Eэ -(0,50-0,60)B в режиме дробного дифференцирования.
В прототипе описано проведение гидролиза сначала 0,10M раствором HCl, затем протеолитическими и фосфатазными ферментами в течение более 16 20 часов. Для определения витаминов ИВ способом использование ферментов значительно снижает экспрессность анализа и делает невозможным проведение вольтамперометрического определения. Предлагаемые условия гидролиза (0,15-0,20) M H2SO4 или HCl при кипячении в течение 30 40 минут позволяют селективно и экспрессно определять водорастворимые витамина B1 и В2 с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение Sr не превышает 0,2 для концентрации определяемых веществ 0,1 мг/100 г. Тиамин и рибофлавин, вероятно, можно было бы определять методом ИВ и без их выделения из основы в отсутствии больших количеств белковых примесей. Присутствие значительных количеств белка в пищевых продуктах мешает ИВ определению витаминов, т.к. белки являются электрохимически активными, хорошо адсорбируются на электродных материалах и могут участвовать в редокс-превращениях , что затрудняет ИВ анализ и приводит к завышенным показателям содержания витаминов в пробах. Для устранения мешающего влияния белков, разрушения связанных форм витаминов и распада белков на более простые составные части в предлагаемом способе гидролиз проводят (0,15-0,20) М H2SO4 или HCl. Концентрации кислот и время гидролиза /t/ (равное 30-40 минутам) подобраны экспериментально. Абсолютной новизной является экспериментально подобранный реагент H2SO4. Использование кислот с молярной концентрацией C<0,15 М ухудшает условия гидролиза, а при C>0,20 М ухудшаются условия ИВ определения из-за большого значения остаточного тока, связанные с выделением водорода на индикаторном стеклоуглеродном электроде. Оптимальным временем гидролиза является 30-40 минут. При t>40 минут снижается экспрессность анализа, а при t<30 минут ухудшаются условия проведения гидролиза.
Другим отличительным признаком являются установленные условия осаждения остаточных количеств растворимого белка из гидролизата (в прототипе осаждение не применяли). Необратимое осаждение белка проводили солями тяжелых металлов (Pb2+, Cu2+, Ag+, Fe2+, Mn2+ и др.). При этом вместе с белками выделялись и их комплексные соединения с фенольными веществами и сахаридами, что обеспечивало оптимальные условия проведения электродного процесса. В предлагаемом способе впервые в качестве осадителя выбрана соль MnCl2· 4H2O в количестве 0,40-0,50 г. Ранее для отделения белка соль MnCl2-4H2O не применялась. Использование больших количеств соли />0,5 г/ повышает растворимость белка, по-видимому, за счет протекания адсорбционной пептизации, и ухудшаются условия проведения электродного процесса, особенно при определении тиамина. При массе соли <0,45 г ухудшаются условия осаждения органических примесей. После отделения осадка центрифугированием проводили вторичное осаждение следов белка из центрифугата с помощью нейтральных солей KCl и (NH4)2SO4 (высаливание следов белковых примесей). Хлорид калия осаждал белки слабее, чем сульфат аммония, вследствие меньшей дегидратирующей способности, которая характеризуется положением ионов в ряду Гофмейстера. Однако применение сульфата аммония ухудшало воспроизводимость и точность электроанализа. Использование KCl способствовало стабилизации условий проведения электродного процесса, повышало точность и воспроизводимость КХА методом ИВ. Масса используемой соли KCl также установлена экспериментально. Использование больших количеств соли KCl />3 г/ понижало электрическую проводимость раствора и ухудшало условия проведения электродного процесса. Уменьшение концентрации соли /<2 г/ ухудшало условия осаждения. Осадок белка мог вновь частично раствориться при стоянии пробы или после разведения пробы водой.
Важным для определения водорастворимых витаминов методом ИВ является выбор фонового электролита. В предлагаемом способе применение дополнительного электролита в качестве фона не требуется. Анализируемый раствор после осаждения белков имеет оптимальное значение pH для ИВ определения, обладает хорошей электропроводностью и поэтому сразу подвергается вольтамперметрированию. Определение тиамина проводят методом катодной ИВ с использованием ртутно-пленочного индикаторного электрода, рибофлавина - адсорбционной ИВ на стеклоуглеродном электроде в режиме дробного дифференцирования. Вольтамперограммы регистрируют при максимальных значениях потенциала -(0,35-0,48)В и -(0,15-0,20)В соответственно для витаминов B1 и B2. Метод ИВ для определения водорастворимых витаминов B1 и B2 в пищевых продуктах ранее не применялся. Массовую долю витамина в пробе вычисляют в мг/100 г по формуле:
где X1 содержание данного компонента в анализируемой пробе, мг/100 г;
Cд концентрация аттестованной смеси /АС/ витамина, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/см3;