Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы (стр. 4 из 18)
Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.
Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, – мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных.
Первые трансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.
По данным Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными. Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась.
Одна из важнейших задач использования трансгенных животных в медицине – получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков.
В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсина человека и β-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200–300 мг химозина – основного компонента для производства сыра. Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была создана первая клонированная овечка – Долли. Исследователи из института Рослина произвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческий интерферон и miR24 антитела для борьбы с меланомой[20].
Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа – трансформации – благодаря введению определенных генов.
Формальным явлением генетической инженерии растений считается получение первого в мире химерного растения – санбина (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower+been) [12].
Получение растений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству тотипотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.
Перенос генов в растительные клетки, так же как и в клетки животных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическим структурам – векторам.
Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей – корончатых галлов (рис. 7).
Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A.tumefaciens[12]. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing – индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды – это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев.
После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина (М. Монтесю и Д. Шелл [6])
Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток – большие размеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными способами невозможно.
В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо её структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений (рис 8).
Существуют и другие бактерии (A.rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing – индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Тi-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы.
Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1–2% вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов. Наиболее изученный представитель группы вирусов с двухцепочечной ДНК – вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветные. Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большого числа копий молекул нуклеиновых кислот – 106 на зараженную клетку.
Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособны встраиваться в хромосомы хозяина.
Методы прямого переноса генов в растение возникли благодаря появлению специфического объекта – изолированных протопластов, т.е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.
1) Трансформация растительных протопластов осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор.
2) Культуру протопластов на начальной стадии её роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов.
3) Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток – 10–20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.
4) Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.
5) Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы – сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.
6) Метод биологической баллистики[6]. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации – суспензионная культура, каллусная ткань или 4–5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.
Решение проблемы создания новых форм растений подразумевает в первую очередь повышение качества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательную и техническую ценность. В основном это касается запасных белков.
Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изучению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и E.coli. Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет передавать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме E.coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к нежелательным эффектам. Так перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может усилить его патогенное действие.