Факультативні заняття з біології (стр. 6 из 10)

Рецепти приготування поживних середовищ.

М'ясо-пептонний бульйон. Для виготовлення найуживаніших поживних середовищ — м'ясо-пептонного бульйону (МПБ), м'ясо-пептонного агару (МПА), м'ясо-пептонного желатину (МПЖ) та інших — насамперед треба приготувати м'ясну воду, оскільки вона є основою всіх цих середовищ. З цією метою свіжу телятину або яловичину звільняють від жиру, сухожилків, фасцій і пропускають через м'ясорубку. До 0,5 кг фаршу додають у два рази більше води, розмішують і настоюють протягом 2 год при температурі 37—39 °С. Одержаний настій проціджують через марлю і кип'ятять 20 хв до зсідання білків. Потім його фільтрують через вату або паперовий фільтр і стерилізують в автоклаві протягом 30 хв при температурі 120 °С і тискові 1 атм.

До 1 л м'ясної води додають 5 г кухонної солі, 10г пептону і кип'ятять до повного розчинення пептону. Додають насичений розчин бікарбонату натрію до слабколужної реакції і знову піддають кип'ятінню протягом 20 хв. Потім доливають водою до початкового об'єму і фільтрують, розливають в колби і пробірки та стерилізують протягом 20 хв в автоклаві при температурі 120 °С. Готовий бульйон повинен бути прозорим і мати янтарно "жовтий колір. Для скорочення часу це середовище часто виготовляють із готових бульйонних кубиків.

М'ясо-пептонний агар виготовляють із м'ясо-пептонного бульйону, додаючи 2—2,5 % подрібненого промитого агару. Суміш кип'ятять до повного розчинення агару, помішуючи її. Потім гарячий розчин фільтрують через ватяно-марлевий фільтр і стерилізують протягом 5 хв при температурі 115 °С у колбах, закритих ватними пробками.

М'ясо-пептонний желатин. До 1 л м'ясо-пептонного бульйону додають 100—150 г желатину і залишають для розбухання, підігрівають до повного розчинення желатину. Встановлюють слаб-колужну реакцію і кип'ятять протягом 5 хв. Далі розчин охолоджують до 40—50 °С, додають змішаний з водою білок курячого яйця і знову підігрівають. При цьому білки випадають в осад і середовище стає прозорим. Його фільтрують гарячим і стерилізують текучою парою (метод тиндалізації).

Бобовий агар. 100г білої квасолі або бобів заливають 1 л води і обережно кип'ятять, уникаючи розтріскування бобів і перетворювання крохмалю на клейстер. Гарячий відвар фільтрують і додають 2 % агару. Агар розплавлюють в автоклаві, осаджують колоїдні частинки. Одержане середовище фільтрують і стерилізують так само, як і при виготовленні інших агарових середовищ.

Картопляне поживне середовище. З неушкоджених бульб картоплі вирізають плоскі шматочки, поверхню яких натирають крейдою для нейтралізації кислої реакції клітинного соку, і розкладають їх у чашки Петрі на зволожений фільтрувальний папір. У разі застосування пробірок краще вирізувати із бульб циліндричні шматочки за допомогою коркового свердла. Чашки і пробірки з картопляним середовищем стерилізують в автоклаві протягом 10 хв при тискові 0,5 атм. На цьому середовищі добре вирощуються картопляна паличка та інші гетеротрофні мікроорганізми.

Сусло-агар. До пивного сусла додають 2 % очищеного агару. Середовище розварюють в автоклаві з відкритим вентилем і використовують для вирощування молочнокислих бактерій і дріжджів.

Щоб приготувати поживне середовище із молока, збиране молоко розливають у пробірки приблизно по 10 мл, закривають ватними тампонами і стерилізують методом тиндалізації. В молочному середовищі містяться всі поживні речовини, необхідні для гетеротрофних мікроорганізмів.

Сухий поживний агар. У навчальних мікробіологічних лабораторіях найчастіше виготовляються поживні середовища з порошку сухого поживного агару або інших видів сухих поживних середовищ (залежно від мети занять), що випускаються мікробіологічною промисловістю. Для цього беруть 5 г порошку сухого поживного агару на 100 мл холодної дистильованої води, старанно розмішують і нагрівають, помішуючи, до повного розчинення агару. Якщо розчин мутний, його фільтрують, а потім розливають у пробірки і стерилізують в автоклаві протягом 20 хв при 120°С.

Розливання поживних середовищ. Для проведення лабораторних занять у навчальних лабораторіях поживні середовища виготовляють, як правило, про запас і зберігають у великих колбах. Перед або на початку заняття середовища розливають у пробірки або чашки Петрі (залежно від мети занять). Тверді поживні середовища перед розливанням необхідно розплавити в автоклаві з відкритим вентилем або на водяній бані.

Після розплавлення середовище розливають у чашки Петрі, пробірки або інший посуд (залежно від мети роботи), дотримуючись умов стерильності. Для цього на полум'ї спиртівки або газового пальника обпалюють горла колб, пробірок, корки тощо. Посуд із середовищем піддають стерилізації.

Таким чином, можемо підвести підсумок, що за складом поживні середовища поділяють на природні та штучні, за призначенням розрізняють прості, або звичайні, спеціальні та диференціально-діагностичні поживні середовища, за консистенцією середовища бувають рідкі, напіврідкі та тверді. Для виготовлення найуживаніших поживних середовищ — м'ясо-пептонного бульйону (МПБ), м'ясо-пептонного агару (МПА), м'ясо-пептонного желатину (МПЖ) та інших — насамперед треба приготувати м'ясну воду, оскільки вона є основою всіх цих середовищ. Існує значні кількість рецептів приготування поживних середовищ. Розливання середовища проводять в колби, чашки Петрі.

Лекція: Методи стерилізації поживних середовищ, посуду та інструментів

Мета: дати поняття про стерилізацію, охарактеризувати способи стерилізації, апаратуру, яка використовується.

План лекції:

1. Поняття про стерилізацію

2. Основні види стерилізації та їх характеристика

Стерилізацією називається повне знищення мікробів та їхніх спор у поживних середовищах, посуді, на інструментах тощо. Серед методів стерилізації розрізнюють фізичні, хімічні, механічні. Фізичні грунтуються на дії високої температури і ультрафіолетового опромінювання, хімічні — на використанні хімічних антисептичних речовин. Фільтрування рідин через бактеріальні фільтри належить до механічних методів стерилізації. У мікробіологічній практиці найчастіше застосовують стерилізацію за допомогою високої температури (так звана термічна стерилізація).

Прожарювання на полум'ї. Цей метод дає добрі результати при стерилізації невеличких за розмірами лабораторних інструментів. Обпалюванням або прожарюванням на полум'ї спиртівки стерилізують бактеріологічні петлі, препарувальні голки, ланцети, пінцети, предметні та накривні скельця, скляні палички, ножиці, шпателі тощо.

Рис. 3. Апарат Коха:

Стерилізація сухим жаром. Чисті колби, чашки Петрі, пробірки, піпетки, різний скляний посуд, загорнутий в папір, стерилізують у спеціальній сушильній шафі при температурі 160—170 °С протягом 2 год. Стерильні предмети виймають з сушильної шафи, коли температура знизиться до кімнатної.

Стерилізація кип'ятінням. Шприци, голки, гумові предмети, хірургічні інструменти стерилізують кип'ятінням у спеціальних стерилізаторах протягом 30 хв. Для зменшення жорсткості води та підвищення температури кипіння у стерилізатори додають 1—2 %-й розчин NaHCO,.

Стерилізація текучою парою, або тиндалізація. Цей метод застосовується для стерилізації речовин, що руйнуються або змінюють властивості при нагріванні (деякі поживні середовища, сироватки, вітаміни тощо). Стерилізацію текучою парою проводять в автоклаві з відкритим паровідвідним краном або використовують апарат Коха (рис. 3). Вона проводиться при температурі 56—58 °С по 30 хв протягом 5—6 днів поспіль.

Стерилізація парою під тиском. Найбільш надійним способом стерилізації поживних середовищ, посуду і матеріалів є стерилізація парою під тиском в автоклавах (рис. 4). При звичайному атмосферному тиску температура водяної пари дорівнює 100 °С. При підвищенні тиску пари температура її значно підвищується. Спільна дія високої температури і тиску пари спричинюють швидку загибель не тільки вегетативних клітин мікробів, а й їхніх спор.

Пастеризація. Метод, запропонований Л. Пастером, застосовується для знезараження харчових продуктів: молока, соків, пива, вина тощо. При цьому матеріал нагрівається при температурі 50—65 °С протягом 15—30 хв або при 70—80 °С — 5—10 хв. Цей метод використовують для знищення неспороносних мікробів. Він може проводитися в термостаті або на водяній бані.

Стерилізація ультрафіолетовими променями. З цією метою використовують бактерицидні лампи. Метод застосовується для стерилізації повітря в мікробіологічних лабораторіях, боксах, операційних, а також деяких предметів і матеріалів. Час опромінення — 20 хв.

А Б В

Рис. 4. Автоклави: А — вертикальний АВ-1; Б — горизонтальний АГ-1; В — автоматичний АШ-250

Під хімічною стерилізацією, або дезінфекцією розуміють знезаражування матеріалів, предметів тощо за допомогою хімічних речовин. У мікробіологічних лабораторіях найчастіше ви-користовують розчин карболової кислоти (3—5 %), лізолу (1—3 %), формаліну (4 %), хлораміну (1—5 %), хлорного вапна (10—20 %) та інші. Борну кислоту, гліцерин, фенол та деякі інші хімічні речовини часто використовують як консерванти при виготовленні лікувальних і діагностичних сироваток, вакцин тощо.

До механічної стерилізації належить фільтрування. Найчастіше стерилізацію фільтруванням застосовують для рідин, що змінюють свої властивості при нагріванні (сироватки, деякі поживні середовища, що містять білки тощо). Фільтрування рідин проводять через спеціальні дрібнопористі фільтри (свічки Шамберлана що їх виготовляють із каоліну, піску і кварцу, фільтри Бергефельда - з інфузорної землі, фільтри Зейтца - із азбесту, а також мембранні фільтри, виготовлені з нітроклітковини). Пори таких фільтрів пропускають рідину, а бактерії затримують.