После отмывки неадсорбированного фермента препарат готов к применению.
На процесс адсорбции и прочность связывания фермента с носителем оказывают определенное влияние различные факторы внешней среды, основными из которых являются: удельная поверхность и пористость носителя, значения рН среды, ионная сила раствора фермента, его концентрация, а также температура проведения адсорбции.
Иными словами, эффективность иммобилизации ферментов определяется сбалансированностью ряда факторов и нарушение этого u1073 баланса может привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем. Для исключения подобной ситуации, на практике используется набор методических приемов, способствующих повышению эффективности процесса и, следовательно, получению более качественных препаратов.
Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля.
Для иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:
• при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а затем уже проводят полимеризацию, в результате которой формируется гель с включенными в него молекулами фермента;
• второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в требуемое состояние, гелеобразное состояние.
Иммобилизация путем включения в полупроницаемые мембраны –состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, способной легко пропускать небольшие молекулы субстрата, задерживая крупные молекулы фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемых мембран и их природой.
К этим модификациям относятся: микрокапсулирование в замкнутых сферических пузырьках, имеющих тонкую полимерную стенку (мембрану).
Метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым приготовленная заранее эмульсия водного раствора фермента в органическом растворе полимера вновь диспергируется в воде. После затвердевания органического раствора образуются полимерные сферические частицы с иммобилизованными в них молекулами фермента.
Способ включения в волокна отличается от метода микрокапсулирования главным образом формой получаемых препаратов. Если при микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы, то при этом способе формируются нити. Для иммобилизации ферментов можно использовать также выпускаемые промышленностью полимерные полые волокна, изготавливаемые из природных или синтетических материалов. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует раствор фермента, погружаются в сосуд с раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокна.
В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках. Существует несколько модификаций данного способа, самой последней из которых является иммобилизация путем включения в полимерные липосомы. Полимерные липосомы характеризуются более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
Основным недостатком всех мембранных систем, применяемых для иммобилизации ферментов, является невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны представляют собой непреодолимые барьеры.
Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа сводится к тому, что ограничение свободы перемещения фермента в системе достигается не вследствие его фиксирования на жестком носителе, а в результате его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что вследствие химических взаимодействий в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, в частности между ним и носителем[15]. Препараты иммобилизованных ферментов, получаемые с использованием химических методов, обладают, по крайней мере, двумя существенными достоинствами. Во-первых, формирующаяся ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующих конъюгатов. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств (субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности).
Существует большое число химических реакций, используемых для ковалентного связывания ферментов с неорганическими носителями (такими, как керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природными полимерами (такими, как сефароза и целлюлоза), а также синтетическими полимерными веществами (нейлон, полиакриламид и другие виниловые полимеры или сополимеры, обладающие реакционно-способными группами).
Во многих из этих процедур ковалентное связывание ферментов с носителем является не специфичным, т. е. ассоциирование фермента с носителем осуществляется за счет химически активных группировок фермента, распределенных по его молекуле случайным образом.
Основным является создание техники конъюгирования, при которой ферменты связывались бы с носителем достаточно эффективно, но без снижения их каталитической активности. Короче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом является своеобразным искусством, уровень которого определяется качествами экспериментатора.
Для получения иммобилизованных ферментов используют большое количество различных как органических, так и неорганических носителей.
Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить для иммобилизации ферментов, следующие:
• высокая химическая и биологическая стойкость;
• высокая механическая прочность;
• достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая пористость;
• возможность получения трубок, листов и т.п.;
• легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);
• высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с ферментом в водной среде;
• невысокая стоимость.
Отсутствие в природе универсальных носителей, обладающих сразу всеми перечисленными свойствами, обусловливает широкий набор применяемых для иммобилизации ферментов материалов.
Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, т. 1–2, пер. с англ. – М.: 2000.
Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. – М.: "Мир", 2002.
Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
Биотехнология, в 8-ми томах // Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. – М.: "Высшая школа", 2005.
Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.
Бочков Н.П., Захаров А.Ф., Иванов В.И. Медицинская генетика. – М.: 2001.
Статьи и монографии сайта // http://www.helpeducation.ru
Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. – Рига: "Зинатне", 2005.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. – М.: «Мир», 2002.
Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: 1999.
Гриневич А.Г., Босенко А.М. Техническая микробиология. – СПб.: 2001.
Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
Маниатис Г., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование (методы генетической инженерии), пер. с англ. – М.: 2001.
Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: "Просвещение", 2000.
Сельскохозяйственная биотехнология. Учебное пособие // Под ред. В.С. Шевелуха. – М.: «Высшая школа», 2003.
Синклер М., Берг П. Гены и геномы. – М.: «Мир», т.1, 2, 2001.
Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ. – М.: 1999.
Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – М.: 2004.
Работа предоставлена пользователем Student.km.ru.
[1] Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.
[2] Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
[3] Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
[4] Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. – Рига: "Зинатне", 2005.
[5] Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. – М.: "Мир", 2002.
[6] Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ. – М.: 1999.
[7] Синклер М., Берг П. Гены и геномы. – М.: «Мир», т.1, 2, 2001.
[8] Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – М.: 2004.
[9] Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
[10] Биотехнология, в 8-ми томах // Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. – М.: "Высшая школа", 2005.
[11] Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
[12] Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: 1999.
[13] Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
[14] Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
[15] Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.