Успеху генетической инженерии способствовала разработка техники объединения генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК. Решающим в конструировании таких гибридных, или рекомбинантных, молекул in vitro явилось обнаружение и получение особых ферментов – рестриктаз, которые сейчас служат основным инструментом Г. и. Рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в участке (сайте), строго определенном для каждой конкретной рестриктазы. К середине 80-х гг. XX в. в мировой коллекции рестриктаз насчитывалось более 400 ферментов, «узнающих» около 100 различных по структуре участков в молекулах ДНК. С помощью рестриктаз стало возможным выделение практически любого гена в виде одного или нескольких фрагментов ДНК.
Появилась возможность снабжать синтезированные, «сконструированные» и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его. Для создания гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК полученные фрагменты соединяют с ДНК вектора. С этой целью используют фермент, соединяющий фрагменты ДНК. Функциональную полноценность гибридной молекулы ДНК определяют с помощью ее переноса в клетку-реципиент по последующему размножению в ней (амплификации) и функционированию. Перенос чужеродного генетического материала в реципиентные клетки и его размножение в них обеспечивает векторная часть гибридной молекулы, а синтез специфического белка – встроенный фрагмент.
Прогресс генетической инженерии во многом обусловлен получением новых специализированных векторов. Для клонирования (размножения) сравнительно небольших фрагментов ДНК длиной до 10 тыс. пар нуклеотидов используют плазмидные векторы. Фрагменты ДНК длиной до 10-25 тыс. пар нуклеотидов клонируют с помощью векторов, полученных на основе фага лямбда. Гибридный геном такого фага, содержащий фрагмент чужой ДНК, искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Гибридный фаг при размножении лизирует клетку, образуя несколько тысяч копий, которые выделяются в культуральную среду. Для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35-45 тыс. пар нуклеотидов используют космидные векторы, представляющие собой гибрид фага лямбда и плазмиды. Космиды содержат так называемые COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий космидным векторам размножаться в бактериях, не лизируя их. Для клонирования небольших фрагментов ДНК длиной до 300-400 пар нуклеотидов в качестве векторов используют производные геномов фагов с однонитевой молекулой ДНК. Вектор, несущий чужеродную ДНК, вводят в бактериальную клетку, где эти гибридные фаги размножаются, не лизируя клетку-хозяина, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусные частицы с однонитевой молекулой ДНК.
Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующей клонированной ДНК-копии (кДНК), получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней – о характере аномалий в клонированном генетическом материале, следствием которых и является это заболевание. Созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Клонировано и в той или иной мере изучено около 1000 генов и других последовательностей нуклеотидов ДНК человека[6].
Возможности генетической инженерии не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо обеспечить экспрессию гена в клетке, т.е. реализовать заключенную в нем генетическую информацию. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то достаточно выделить ген с его собственными регуляторными элементами, контролирующими экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, например, экспрессии гена высших организмов в клетках Е, coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена.
Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы BAL31, которая обладает уникальным свойством удалять с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» которых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи. Затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область гена высшего организма (эукариотического гена) с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов. В качестве реципиентов эффективно используют не только бактериальные клетки, но и клетки высших организмов[7].
С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, которые являются причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так называемый блот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают расщеплению рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза. Однотипные фрагменты ДНК инкубируют с ранее клонированным геном (или его частью) либо с полученной путем химического синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащих радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, которые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов/
Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или в близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов. Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при расщеплении этими ферментами молекула ДНК распадается на ряд фрагментов различной длины (так называемые рестрикционные фрагменты). Перестройка структуры ДНК, в результате которой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания». приводит к изменению набора этих фрагментов, т.е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике.
Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ проводят в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке. Из набора клонированных участков генома (или кДНК) с неизвестной функцией, характеризующихся определенным ПДРФ, выделяют те из них, которые наиболее тесно сцеплены с конкретным признаком. Если признаком является наследственное заболевание, с помощью выявления тесно сцепленного с ним полиморфного фрагмента можно осуществить диагностику этого заболевания по наличию той или иной формы ПДРФ. Этот подход позволил разработать методы ранней пренатальной диагностики, выявления носителей патологического гена в семьях даже для таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшенна, муковисцидоз, природа генетических дефектов при которых была абсолютно не известна. Затем можно точно определить положение соответствующего гена на хромосоме, выделить и проанализировать не только ген, но и продукты его так называемой экспрессии (мРНК и белок) в норме и при патологии. Полностью принципиальная схема «генетики наоборот» успешно реализована в случае болезни Дюшенна, муковисцидоза.
На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.
Практическое значение генетической инженерии для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов у человека, создания и использования микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета. Разработаны методы синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов и т.д., основанные на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены.