Биотехнология (стр. 2 из 7)

Процесс культивации микроорганизмов – ферментация – начинается с того момента, когда заранее подготовленный посевной материал вводится в реактор. Размножение культуры микроорганизма характеризуется четырьмя временными фазами[4]: лаг-фаза; экспоненциальная; стационарная; вымирание.

Во время лаг-фазы метаболизм клеток направлен на то, чтобы синтезировать ферменты для размножения в конкретной среде. Длительность лаг-фазы может быть разной для одной и той же культуры и среды, так как на неё влияет множество факторов. Например, сколько в посевном материале было нерастущих клеток.

Экспоненциальная фаза – это период роста, когда происходит деление клеток с экспоненциальным ростом численности популяции. Этот период ограничен во времени количеством питательной среды. Питательные вещества кончаются или рост клеток замедляется из-за выделения токсичного метаболита.

Рост прекращается и наступает так называемая стационарная фаза. Метаболизм продолжается и может начаться выделение вторичных метаболитов. Во многих случаях целью является получение не биомассы, а именно вторичных метаболитов, так как они могут использоваться для получения ценных продуктов и препаратов. В этих случаях ферментация целенаправленно удерживается в стационарной фазе.

Если продолжать фермениацию дальше, клетки постепенно будут терять активность, т.е. вымирать.

По характеру подкормки процессы культивирования бывают трёх видов:

периодический;

подкормочный;

непрерывный.

В периодическом процессе реактор заполняется свежей питательной средой, потом в него вводится посевной материал. По окончании ферментации содержимое выводится на стадию выделения, реактор моется и стерилизуется, и всё начинается снова.

В подкормочном процессе непрерывно или порциями в реактор вводится свежая питательная среда. Скорость ввода обычно определяется скоростью роста или биосинтеза. Когда реактор наполняется, его частично или полностью опорожняют. Процесс завершается или продолжается.

В непрерывном процессе культивационная жидкость выводится из реактора непрерывно. Такой процесс может протекать очень долго, и его длительность обычно определяется производственной необходимостью и техническими факторами.

Наиболее распространена ферментация с подкармливанием, её чаще всего применяют для биопродуктов. В этом случае устраняются недостатки периодического процесса путём небольших технических изменений.

Непрерывные процессы чаще всего применяются при производстве биохимикатов в больших количествах. Эти процессы самые экономичные, но для их реализации нужны значительные технические преобразования и более глубокое понимание кинетики данной ферментации.

Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).

Глубинная ферментация проводится в аппаратах емкостью 50 м3 с заполнением на 70–75 %. В качестве посевного материала используют мицелий, подрощенный также в условиях глубинной культуры. В производственном аппарате, куда подрощенный мицелий передается по стерильной посевной линии, питательная среда содержит 12–15 % сахаров. Ферментацию проводят при 31–32° при непрерывном перемешивании. В ходе процесса кислотообразования (5–7 суток) реализуют интенсивный режим аэрации (до 800–1000 м3/ч) с дробным добавлением сахаров, 2–3 подкормки. Выход лимонной кислоты составляет от 5 до 12 %, остаточная концентрация сахаров – 0.2–1.5 %, доля цитрата – 80–98 % от суммы всех органических кислот.

Получить производные антибиотиков можно с помощью как химического, так и биологического синтеза. Известен и комбинированный способ получения препаратов. В этом случае ядро молекулы антибиотика формируется при биосинтезе с помощью соответствующих микроорганизмов-продуцентов, а «достройка» молекулы осуществляется методом химического синтеза. Полученные этим способом антибиотики называются полусинтетическими. Так были получены и нашли широкое применение в клинике весьма эффективные полусинтетические пенициллины (метициллин, оксациллин, ампициллин, карбенициллин) и цефалоспорины (цефалотин, цефалоридин) с новыми по сравнению с природными антибиотиками ценными терапевтическими свойствами.

Все эти данные, накопленные в процессе становления и развития науки об антибиотиках, потребовали уточнения термина «антибиотики». В настоящее время антибиотиками следует называть химические соединения, образуемые различными микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, а также производные этих соединений, обладающие способностью в незначительных концентрациях избирательно подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Вполне вероятно, что и эта формулировка с дальнейшим прогрессом антибиотической науки будет уточняться.

В первые годы после открытия антибиотиков их получали с использованием метода поверхностной ферментации. Этот метод заключался в том, что продуцент выращивали на поверхности питательной среды в плоских бутылях (матрацах). Чтобы получить сколько-нибудь заметные количества антибиотика, требовались тысячи матрацев, каждый из которых после слива культуралыюй жидкости необходимо было мыть, стерилизовать, заполнять свежей средой, засевать продуцентом и инкубировать в термостатах. Малопроизводительный способ поверхностной ферментации (поверхностного биосинтеза) не мог удовлетворить потребностей в антибиотиках. В связи с этим был разработан новый высокопроизводительный метод глубинного культивирования (глубинной ферментации) микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Это позволило в короткий срок создать и развить новую отрасль промышленности, выпускающую антибиотики в больших количествах.

Метод глубинного культивирования отличается от предыдущего тем, что микроорганизмы-продуценты выращивают не на поверхности питательной среды, а во всей ее толще. Выращивание продуцентов ведут в специальных чанах (ферментаторах), емкость которых может превышать 50 м3. Ферментаторы снабжены приспособлениями для продувания воздуха через питательную среду и мешалками. Развитие микроорганизмов-продуцентов в ферментаторах происходит при непрерывном перемешивании питательной среды и подаче кислорода (воздуха).

При глубинном выращивании во много раз по сравнению с выращиванием продуцента на поверхности среды увеличивается накопление биомассы (из расчета на единицу объема питательной среды), а значит, и возрастает содержание антибиотика в каждом миллилитре культуральной жидкости, т. е. повышается ее антибиотическая активность.

3.Генетическая инженерия. Ферментный синтез генов на основе изолированной матричной РНК.

Генетическая инженерия – направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в т.ч. не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств[5].

В основе генетической инженерии лежат достижения молекулярной биологии и прежде всего установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Возможность получения и направленного использования фрагментов нуклеиновых кислот, выделения отдельных участков полинуклеотидной цепи с точностью до одного нуклеотида и осуществления in vitro синтеза нуклеиновых кислот с новыми сочетаниями нуклеотидных звеньев, появилась у генетической инженерии благодаря успехам энзимологии.

Изменение наследственных свойств организма с помощью генетической инженерии состоит в конструировании из различных фрагментов ДНК нового генетического материала, введении этого материала в организм реципиента, создании условий для функционирования введенного генетического материала и его стабильного наследования. Гены или фрагменты ДНК могут быть получены путем химического синтеза. Однако этот процесс трудоемок и требует знания последовательности нуклеотидов, составляющих ген. Более эффективен метод синтеза структурного гена на информационной РНК (иРНК) как на матрице с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Однако структурные гены в организме составляют функциональный комплекс с регуляторными элементами, нуклеотидные последовательности которых не воспроизводятся в молекуле иРНК. Поэтому указанный способ не позволяет осуществить синтез структурной и регуляторной области гена в совокупности, т.е. функционирующего гена в целом.

Методы получения целого функционирующего гена были впервые разработаны на бактериальных клетках. Их основой является способность некоторых плазмид – небольших молекул ДНК, способных реплицироваться независимо от бактериальной хромосомы, – внедряться в хромосому бактериальной клетки, а затем спонтанно или под воздействием индуцирующих агентов, например УФ-излучения, снова переходить в цитоплазму, захватывая при этом прилегающие гены хромосомы клетки-хозяина. В цитоплазме эти гены реплицируются (размножаются) в составе захвативших их плазмид. Фрагмент генетического материала хромосомы бактериальной клетки может быть отделен от плазмиды. Использование плазмид позволяет получать в изолированном виде практически любые бактериальные гены.