Мало известно о механизме ПКС у растений. В сравнении с естественными индукторами ПКС химические и физические воздействия методически более привлекательны, поскольку вызывают синхронный апоптоз с высоким выходом погибших клеток, что облегчает последующий анализ результатов. Так, апоптоз у растений можно вызвать обработкой CN– [98-100], менадионом [101], тепловым воздействием [102].
Показано [100], что NaCN вызывает разрушение ядер в эпидермальных и устьичных клетках листьев гороха. Устьичные клетки значительно устойчивее к CN–, чем эпидермальные. Свет ускоряет CN.-индуцированноеразрушение ядер в устьичных клетках. Эффект света незначителен на эпидермальных клетках, которые, в отличие от устьичных клеток, не содержат хлоропластов. Эти данные могут указывать на возможное участие хлоропластов в CN–-индуцированной гибели устьичных клеток. Антиоксиданты (ионол и витамин Е) тормозят CN–-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках. Витамин Е в значительной степени снимает эффект CN– на устьичные клетки. Салициловая кислота – ингибитор каталазы и аскорбатпероксидазы – индуцирует 100%-ное разрушение ядер в эпидермальных клетках, но не оказывает значительного влияния на состояние ядерного аппарата в устьичных клетках. Предполагается, что CN–, ингибируя каталазу и пероксидазы, приводит к образованию и накоплению АФК, индуцирующих апоптоз. Подобно митохондриям, играющим важную роль в апоптозе животных, возможно участие хлоропластов в апоптозе растений [100].
Гиперчувствительный ответ на заражение патогенными возбудителями тоже сопровождается накоплением АФК в клетках растений. Это обусловлено подавлением экспрессии аскорбатпероксидазы и каталазы. Трансгенные растения табака, у которых синтез этих ферментов подавлен, гиперчувствительны к патогенам: у них ПКС вызывается низкими дозами патогенов, которые не оказывают влияния на контрольные растения [103].
Действие менадиона как индуктора апоптоза, по-видимому, тоже связано с образованием АФК: восстанавливаясь компонентами дыхательной цепи митохондрий, менадион спонтанно окисляется О2 в одноэлектронной реакции. Обработка протопластов табака менадионом ведет к выходу цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, деградации поли(ADP-рибозо)полимеразы (ПАРП), фрагментации ДНК [101]. Тетрапептидные ингибиторы каспаз предотвращают расщепление ПАРП (субстрата каспазы-3 у животных), но не влияют на выход цитохрома с из митохондрий. Выход цитохрома с в цитоплазму и фрагментация ДНК наблюдаются также при тепловой обработке (55Ъ, 10 мин) семядолей этиолированных проростков огурца [102].
Экспрессия проапоптозного белка Bax вызывает ПКС у растений табака [104]. Bax-индуцированная ПКС фенотипически сходна с гибелью клеток при гиперчувствительном ответе на заражение вирусом табачной мозаики. В рисе и арабидопсисе выявлен ген ингибитора белка Bax. Экспрессия этого гена подавляет Bax-индуцированную гибель дрожжей Saccharomyces cerevisiae [105].
Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют об общности механизмов ПКС у животных и растений.
Программируемая гибель у микроорганизмов
По данным анализа полностью и частично расшифрованных геномов, у микроорганизмов идентифицированы белки, соответствующие апоптозным факторам млекопитающих [46]. Так, у слизистого гриба из группы акразиевых, Dictyostelium discoideum содержится адаптер TRAF. У дрожжей обнаружен лиганд LRR (leucine-rich repeat), адаптерные домены BIR и MATH, у бактерий – лиганд LRR, адаптерный домен TIR, АТРазный домен фактора APAF-1, гомолог каспазы. Эти микробные домены, по-видимому, вовлечены в различные регуляторные механизмы [46].
Гриб D. discoideum имеет сложный цикл развития (рис. 6). В этом цикле фаза обособленных амебоидных вегетативных клеток, размножающихся бинарным делением, сочетается с формированием видимых невооруженным глазом подвижных клеточных скоплений (мигрирующего псевдоплазмодия) и далее с построением многоклеточного плодового тела, в котором отдельные амебы покрываются оболочкой (инцистируются) и превращаются в споры, прорастающие в благоприятных условиях в амебоидные вегетативные клетки. Образование псевдоплазмодия – реакция на нехватку пищи (см. обзоры [106–108]). Клетки на переднем конце псевдоплазмодия погибают с признаками ПКС [109]. Из погибших клеток формируется ножка плодового тела. Процесс находится под влиянием ряда межклеточных коммуникационных агентов: сАМР и в особенности 1-(3,5-дихлор-2,6-гидрокси-4-метоксифенил)-1-гексанона [107]. Ингибиторы каспаз не предотвращают гибели клеток в ножке плодового тела D. discoideum , т.е. ПКС в данной системе, по-видимому, не зависит от классических механизмов апоптоза [110].
Процесс, аналогичный ПКС, у ресничных инфузорий – разрушение макронуклеуса (большего клеточного ядра) с деградацией его ДНК, наступающее в связи с конъюгацией, необходимой для рекомбинации ДНК в малом клеточном ядре – микронуклеусе [111].
Паразитический жгутиконосец Trypanosoma cruzi имеет три основные стадии жизненного цикла: эпимастиготы, трипомастиготы и амастиготы. Эпимастиготы интенсивно делятся, обитая в кишечнике кровососущих насекомых. Они далее дифференцируются в неделящихся трипомастигот, которые, попадая на кожу позвоночного животного (или человека) с экскрементами кровососущих насекомых, внедряются в клетки позвоночных и превращаются в активно делящихся внутриклеточных паразитов амастигот. Амастиготы продуцируют новые трипомастиготы, которые выходят из клеток и распространяются с током крови, попадая в новые клетки (и давая амастиготы) или в кишечник насекомого-кровососа (превращаясь в эпимастиготы). Установлено, чтопри выращивании T. cruzi in vitro при 27оС (моделирование условий кишечника насекомого) эпимастиготы через некоторое время образуют трипомастиготы, причем появление трипомастигот сопряжено с массовой (программируемой?) гибелью эпимастигот. Предполагаемый смысл ПКС – неделящиеся трипомастиготы, необходимые для распространения паразита на позвоночного хозяина, следует оберегать от конкуренции за ресурсы с интенсивно пролиферирующими эпимастиготами [112].
Рассмотренные формы клеточной гибели у Protozoa связаны с процессами дифференцировки и проявляют функциональную общность с ПКС при онтогенетическом развитии животных и растений, например, при отмирании хвоста у головастика и формировании листьев у растений.
Дрожжи не содержат регуляторных факторов апоптоза, подобных Bcl-2 и Bax. Такие белки отсутствуют и у растений [25]. Однако рост Saccharomyces сerevisiae и Schizosaccharomyces pombe подавляется при экспрессии проапоптозных белков Baх и Bak. Дрожжевые клетки погибают с характерной для апоптоза картиной (накопление фосфатидилсерина во внешнем монослое цитоплазматической мембраны, конденсация хроматина, фрагментация ДНК, распад клеток на апоптозные везикулы). ПКС дрожжей предотвращается при соэкспрессии антиапоптозных белков Bcl-2 или Bcl-XL. [57, 113, 114]. Cверхэкспрессия Bcl-XL у растений табака не блокирует ПКС в ответ на вирусную и бактериальную инфекции [115]. Поскольку гибель Вах-экспрессирующих клеток у бродящих S. cerevisiae (отсутствуют митохондрии) выражена слабее, чем у дышащих (имеются митохондрии), предполагается, что цитохром с и митохондриальный переносчик адениннуклеотидов участвуют в Вах-индуцированном ПКС дрожжей [116].
Проапоптозные белки активны у дрожжей, хотя их клетки не синтезируют каспазы. Экспрессия каспазы-3 тормозит рост S. сerevisiae, но не вызывает их гибели [117]. Торможение снимается при нарушении структуры активного центра каспазы-3 в результате мутации. Соэкспрессия вирусного ингибитора каспазы-3 или добавление пептидного ингибитора z-VAD.fmk снижают действие экспрессированной каспазы-3 на рост клеток [117]. У животных Bax индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз. Этот путь ПКС предположительно связан с накоплением в клетке активных форм кислорода. Вероятно, существует общий для дрожжей и млекопитающих эволюционно-консервативный бескаспазный путь ПКС, зависящий от активных форм кислорода [118].
Описанные примеры ПКС у дрожжей связаны с экспрессией чужеродных генов, не имеющих аналогов в геноме дрожжей. Однако ПКС характерна для S. сerevisiae и в ходе реализации программы нормального развития. Так, материнская клетка, от которой отпочковываются дочерние клетки S. сerevisiae, по-видимому, элиминируется после формирования на ней 20-30 почек [2].
Что ожидать от прокариот, если у них экспрессировать белки, замешанные в механизме ПКС у млекопитающих? Такие эксперименты проведены на Escherichia coli [119]: клетки бактерии погибают при экспрессии внутриклеточной части рецептора Fas T-лимфоцитов человека.
Прокариотическим аналогом апоптоза можно считать гибель части клеточной популяции E. coli и ряда других бактерий в условиях стазиса – остановки роста бактериальной популяции (при исчерпании питательного субстрата, под влиянием того или иного стрессорного фактора). Так, голодающая популяция E. coli разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, в то время как другая субпопуляция использует продукты автолиза как питательный субстрат и продолжает расти, синтезировать РНК (судя по включению 3Н-уридиновой метки) и формировать колониеобразующие единицы [120]. Раскрыт генетическиймеханизм ПКС в подобных прокариотических системах [121, 122]. Геном E. coli содержит оперон с двумя генами: mazE и mazF (рис. 7). Ген mazF кодирует стабильный цитотоксический белок, а mazE – нестабильное противоядие к белку MazF, быстро разрушаемое протеазой. В условиях голодания, когда происходит исчерпание фонда свободных аминокислот активируется оперон rel, чей белковый продукт RelA отвечает за синтез гуанозинтетрафосфата. Гуанозинтетрафосфат блокирует экспрессию обоих генов: противоядие разрушается, и в результате стабильный белок-яд MazF вызывает гибель и автолиз части популяции, тем самым пополняя фонд аминокислот и вновь активируя синтез противоядия MazF у оставшихся в живых клеток E. coli [121, 122].