Введение.
Метилирование ДНК - это процесс ковалентного присоединения in vivo метильной группы к основаниям в составе ДНК.
5-метилцитозин (5-МеС) был первым обнаруженным модифицированным основанием (Hotchkiss R.D., 1948). Метилирование цитозиновых остатков геномной ДНК имеет место у бактерий, растений, животных, в том числе и млекопитающих (включая человека), но отсутствует у дрожжей и нематод (Caenorhabditis elegans). Помимо 5-МеС ДНК прокариот содержит модифицированное основание N6-метиладенин, тогда как ДНК высших эукариот - только 5-МеС (Bird A.P., 1995). Поскольку нуклеотидная последовательность при этом не изменяется, то по своей сути метилирование - событие эпигенетическое (Baylin S.B., et al, 1998).
Наиболее сложные функции метилирование ДНК выполняет в клетках млекопитающих. Оно вовлечено в такие фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки, как регуляция экспрессии генов и поддержание стабильности генома. В первом случае - это стабильная репрессия транскрипции определенных генов (гены инактивированной Х-хромосомы у самок, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов), во втором - регуляция процессов рекомбинации и защита генома от инвазии и распространения чужеродной информации. Очевидно, что многообразие функций метилирования и важность процессов, в которых оно участвует, предполагает наличие достаточно жесткой регуляции. В исследованиях на экспериментальных моделях было показано, что нарушение регуляции метилирования в эмбриогенезе может приводить к гибели организма. Изменение степени метилирования в соматических клетках взрослого организма наблюдается при некоторых патологических состояниях у человека, в том числе и злокачественных новообразованиях. Далее будут рассмотрены современные представления о метилировании ДНК в клетках млекопитающих и его роли в канцерогенезе.
Метилирование ДНК в нормальных клетках.
Для понимания роли метилирования при канцерогенезе необходимо знание закономерностей протекания этого процесса в нормальном организме.
Клетки млекопитающих обладают способностью эпигенетически модифицировать свой геном путем энзиматического по пятому положению метилирования остатков цитозина в составе 5/-CpG динуклеотидов. Цитозиновый остаток в составе 5/-GpC или любых других динуклеотидов не метилируется. Приблизительно 70-80% CpG динуклеотидов в геномах млекопитающих метилированы (Baylin S.B., et al, 1998). Одновременно, их распределение в ДНК является не случайным, и, в целом, геномы обеднены по отношению к CpG динуклеотидам (Antequera F. & Bird A., 1993). Предполагается, что именно метилирование сыграло в этом критическую роль. 5-МеС в составе CpG динуклеотидов гипермутабилен, поскольку аминогруппа в шестом положении цитозинового кольца крайне нестабильна. 5-МеС может легко подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием тимина. Это обстоятельство вело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G-C на А-Т, в результате чего динуклеотидов CpG в составе ДНК приблизительно в 5 раз меньше (~1 CpG на 80 динуклеотидов), чем следовало бы (1 на 16) (Gardiner-Garden V. & Frommer M., 1987).
Существуют два вида распределения CpG динуклеотидов в составе ДНК млекопитающих. Первое - это рассеянные CpG (их ~80% от общего количества). Они рассредоточены по всему геному в виде одиночных динуклеотидов, причем особой закономерности в их распределении выявить невозможно. Чаще всего они встречаются в интронах и намного реже в транскрибируемых областях. Значительная часть тканеспецифичных генов имеют в своих промоторах одиночные CpG. Степень их метилирования может быть различной в разных клетках и тканях (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001).
Второй вид распределения заключается в следующем. В геномах млекопитающих существуют короткие (от 500 до 5000 пар нуклеотидов) последовательности, где CpG динуклеотиды распределены кластерами. Плотность их близка к расчетной (1 на 16), а содержание G + C превышает 60%. Такие последовательности получили название CpG-островков. Характерным свойством этих структур является их частая локализация в 5/-регуляторных районах генов, но они также встречаются и в интронах, а также на 3/- концах генов. Свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека, содержат CpG-островки. К их числу относятся, по-видимому, все гены домашнего хозяйства, около 40% тканеспецифичных генов, многие протоонкогены и гены супрессоры опухолевого роста. CpG-островки, ассоциированные с регуляторными областями генов, неметилированы во всех тканях эмбриона и взрослого организма (включая и гаметы), независимо от того, экспрессируются в них гены или нет. Исключение составляют только гены, расположенные на инактивированной Х-хромосоме у самок, а также импринтированные гены, которые экспрессируются только с одного из двух аллелей, материнского или отцовского. У этих генов в нормальных клетках CpG-островки метилированы (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Кроме того, большую часть генома млекопитающих (~95%) составляет генетический балласт или junk ДНК, участки которой, подвергаются интенсивному метилированию. Например, к числу последовательностей, обогащенных CpG динуклеотидами, относятся транспозоны (~25% генома человека) и сателлитные повторы (~10% генома человека). Эти паразитические элементы метилированы во всех изученных сайтах генома нормального взрослого организма (Selker E.U., 1999). Подобным же образом в нормальных клетках грызунов и человека интегрированные вирусные последовательности подвергаются метилированию и обусловленному им стабильному блоку транскрипции (Walsh C.P., et al, 1998).
Паттерн метилирования конкретных генов и генома в целом устанавливается в процессе эмбриогенеза и стабильно сохраняется в популяциях соматических клеток взрослого организма. Так, вскоре после оплодотворения, на стадии 1-2 клеточных делений, происходит тотальное деметилирование генома, устраняющее паттерн исходных половых клеток. Деметилированное состояние ДНК сохраняется до стадии имплантации бластоцисты (Razin A. & Shemer R., 1995). На постимплантационной стадии начинается процесс метилирования de novo, когда большинство CpG-сайтов вновь метилируется, за исключением тех, что находятся в составе CpG-островков (Tuker M.S., 1999). Механизм, позволяющий CpG-островкам избегать метилирования de novo в эмбриогенезе, пока неизвестен. Предполагают, что защитную роль в этом процессе играют специфические цис-действующие генетические элементы. В настоящее время такая функция доказана для последовательности, являющейся одновременно сайтом узнавания транскрипционного фактора Sp1 (Tuker M.S., 1999). Позднее, в процессе дифференцировки происходит локальное деметилирование индивидуальных генов. В результате этих последовательных событий 70-80% CpG-сайтов в геноме человека и мыши оказывается метилированными. Сформированный профиль метилирования затем сохраняется в ряду клеточных поколений. Поддерживающее метилирование осуществляется только в тех сайтах вновь синтезированной цепи ДНК, где в исходной цепи уже содержались CpG динуклеотиды с метилированным остатком цитозина (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001).
В настоящее время у млекопитающих, включая человека, известны четыре фермента, осуществляющие метилирование геномной ДНК. Это ДНК-метилтрансферазы: Dnmt1, Dnmt2, Dnmt 3a и 3b (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001; Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Dnmt1 - наиболее изученный на сегодня фермент системы метилирования ДНК у позвоночных. Гомозиготная делеция dnmt1 у мышей приводит к летальному исходу на стадии эмбриона (Li E., et al, 1993). Именно это наблюдение явилось доказательством необходимости метилирования ДНК у высших эукариот. В структуре Dnmt1 были выявлены два домена: каталитический и регуляторный. Каталитический домен локализован в С-концевой области белка и структурно близок к бактериальным цитозиновым метилтрансферазам. В свою очередь, регуляторный домен расположен в N-концевой части Dnmt1 и содержит специальную сигнальную последовательность, направляющую фермент в активные репликативные комплексы делящихся клеток (Bestor T.H. & Verdin G.L., 1994). Активность фермента резко возрастает с началом синтеза ДНК и в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити воссоздается по образцу материнской. Dnmt 3a и 3b, как оказалось, необходимы для метилирования de novo (Okano M., et al, 1998a). Инактивация соответствующих генов несовместима с развитием зародыша у мыши. Ферменты экспрессируются на высоком уровне в эмбрионах и на очень низком в соматических клетках взрослого организма. Эти ферменты различаются по своим функциям, так как только Dnmt3b небходима для метилирования центромерных минисателлитных повторов (Okano M., et al, 1999). Функции Dnmt2 остаются пока неясными (Okano M., et al, 1998b).
В настоящее время ничего не известно и о том, как происходит тотальное деметилирование генома в эмбриогенезе. Только совсем недавно была открыта ДНК-деметилаза, которая по своим свойствам является весьма вероятным кандидатом на роль фермента, осуществляющего тотальное деметилирование. ДНК-деметилаза способна узнавать метилированные CpG динуклеотиды и трансформировать 5-МеС в цитозин, не нарушая целостности ДНК (Bhatacharya S.K., et al, 1999). Что касается механизма локального деметилирования, то для нескольких тканеспецифичных генов установлено, что этот процесс контролируется определенными цис-действующими генетическими элементами, которые узнаются специфическими транс-действующими белковыми факторами (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001).
Метилирование подавляет экспрессию на уровне транскрипции. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых метилирование может препятствовать транскрипции. Один из них заключается в прямом ингибировании связывания специфических транскрипционных факторов (c-Myc/Myn, AP-2, E2F и ATF/CREB-подобные белки), чьи сайты узнавания содержат одиночные метилированные CpG динуклеотиды (Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Второй механизм репрессии опосредуется через метил-CpG связывающие белки, такие как MeCP1 и MeCP2, известные также как MBD-семейство (Boyes J. & BirdA., 1992). Они не проявляют специфичности к последовательности немодифицированных нуклеотидов, но обладают высокой степенью родства к метилированной ДНК. Наиболее изученный из них, MeCP2 локализуется в ядре в гетерохроматине (неактивен, конденсирован, реплицируется в поздней S-фазе). Структура белка включает 2 домена: один связывает метилированные CpG, второй обеспечивает функции репрессора транскрипции. Взаимодействуя с метилированными основаниями, MeCP2 рекрутирует корепрессорный комплекс mSin3a/HDAC (гистондеацетилаза), который осуществляет деацетилирование N-концевых аминогрупп гистонов. В результате гистоны приобретают дополнительный положительный заряд и способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции. Напротив, рекрутирование в комплекс с транскрипционными факторами белков с гистонацетилазной активностью (НАТ) способно снимать репрессирующее действие метилирования, приводя к образованию эухроматина (деконденсирован, потенциально активен, реплицируется в ранней S-фазе) (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001; Spencer T.E., et al, 1997).
Таким образом, наряду с формированием репрессивных комплексов на основе обычных белков - репрессоров, узнающих специфические последовательности, высшие эукариоты с усложненным геномом обладают дополнительным уникальным эпигенетическим механизмом регуляции транскрипции, который наследуется дочерними клетками при делении.
Нарушения метилирования ДНК при канцерегенезе.
За последние 15-20 лет было установлено, что паттерн метилирования в неопластических клетках значительно изменяется по сравнению с нормальными клетками, причем тотальное деметилирование генома сопровождается увеличением активности метилтрансферазы и локальным гиперметилированием CpG-островков. Во всех, без исключения, исследованных неоплазиях наблюдается подобный дисбаланс метилирования. В свете описанных выше функций метилирования в нормальных клетках, очевидно, что эти нарушения могут изменять структуру хроматина и функции ДНК, внося тем самым значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности опухолевой клетки.
1. Тотальное гипометилирование генома.
Было обнаружено, что одним из первичных нарушений метилирования ДНК в неопластических клетках, является тотальное гипометилирование генома. Уменьшение количества метильных групп является одним из ранних, зачастую еще до появления сформированной опухоли, событием в клеточной трансформации. Напрямую роль гипометилирования ДНК в процессе клеточной трансформации была доказана на основании данных о том, что содержание грызунов на безметиониновой диете, ведущей к дефициту доноров метильных групп, вызывает гипометилирование ДНК и образование опухолей печени (Pogribny I.P., et al, 1995). Несмотря на явную ассоциацию гипометилирования ДНК с процессом образования опухолей, причины и конкретные механизмы, обуславливающие его канцерогенный эффект, до сих пор остаются неясными. Есть данные, что гипометилирование может затрагивать определенные онкогены, такие как К-ras при раке легкого и кишечника у человека. Эти локальные ген-специфические изменения возникают на ранних стадиях канцерогенеза и обнаружены, в частности, в доброкачественных полипах, которые являются предшественниками карциномы кишечника (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Тем не менее, спектр генов, активируемых в опухолях в результате гипометилирования генома, ограничен. Вероятно, это объясняется тем, что гипометилирование затрагивает рассеянные CpG динуклеотиды. CpG-островки не могут быть объектами деметилирования. Исключение составляют импринтированные гены и гены на инактивированной Х-хромосоме у самок. Таким образом, деметилирование может затрагивать группы тканеспецифичных генов, содержащих в регуляторных областях одиночные CpG динуклеотиды.
Нарушение импринтинга в результате деметилирования и его роль в канцерогенезе были доказаны при изучении опухоли Вильмса (Jirtl R.L., 1999). Опухоль этого типа развивается у детей в раннем возрасте из метанефрических бластных клеток. Существуют спорадическая и наследственная формы заболевания (RyanG., et al , 1995). Было обнаружено, что в 70% случаев в опухолях Вильмса имеет место аберрантное деметилирование материнского аллеля и биаллельная экспрессия гена инсулинподобного фактора роста IGF2. Как известно, при сверхэкспрессии IGF2 проявляет свойства онкогена. Биаллельная экспрессия IGF2 часто наблюдается в фенотипически нормальных тканях окружающих опухоль, т.е. является ранним событием при возникновении опухоли Вильмса. Нарушение импринтинга IGF2 наблюдается более чем в 20 различных типах опухолей (Jirtl R.L. , 1999).
Как уже упоминалось выше, тотальное гипометилирование генома может, изменяя структуру хроматина и переводя его в активное состояние, косвенно влиять на экспрессию генов. Так, было показано, что деметилирование генома нормальных клеток под воздействием 5-азацитидина ведет к трансформации некоторых клеточных культур и нарушению процесса расхождения хромосом во время митоза (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001).
Еще одним следствием тотального гипометилирования и, возможно, наиболее вероятным, является возникающая в результате нарушения паттерна метилирования общая нестабильность генома. Так гипометилирование ДНК в эмбриональных клетках мыши, нокаутированных по гену dnmt1, увеличивало частоту реарранжировок эндогенных ретровирусов и паразитических последовательностей, частоту образования делеций и транслокаций некоторых уникальных генов, т.е. являлось причиной хромосомных аномалий и последующего летального исхода (Chen R.Z., et al, 1998). Однако, для опухолевых клеток пока отсутствуют данные, которые подтвердили бы, что перечисленные нарушения, всегда присутствующие в них, являются прямым следствием тотального гипометилирования.
2. Локальное гиперметилирование.
Локальное гиперметилирование распространяется на небольшую часть CpG динуклеотидов (~20%), которые входят в состав CpG-островков. CpG-островки, за известными исключениями, всегда неметилированы в нормальных клетках. Аберрантное гиперметилирование CpG-островков является особенностью иммортализованных и трансформированных клеток и связано с инактивацией определенных генов супрессоров опухолевого роста y человека (Toyota V. & Issa J.-P.J., 1999).
Механизм локального гиперметилирования не вполне ясен. По-видимому, важную роль в этом процессе играет повышение метилтрансферазной активности, тем более что оно является характерным свойством опухолевых клеток (Robertson K.D., et al, 1999). При исследовании некоторых клеточных культур было показано, что повышение ДНК-метилтрансферазной активности зачастую предшествует злокачественной трансформации. Так, трансфекция клонированного гена человеческой Dnmt1 в иммортализованные фибробласты человека приводит к аберрантному метилированию CpG-островков в промоторных зонах ряда генов, в том числе генов E-cad (E-cadherin) и HIC1 (hypermethylated in cancer). В тоже время, CpG-островки, ассоциированные с другими генами (например, с геном-супрессором p16INK4A), не меняют статус метилирования, несмотря на постоянную экспрессию Dnmt1 (Vertino P.M., et al, 1996). Таким образом, очевидно, что повышение активности Dnmt1 играет определенную роль в аберрантном метилировании CpG-островков. Однако простым повышением уровня экспрессии нельзя объяснить появление у фермента способности к метилированию de novo. По-видимому, в трансформированных и опухолевых клетках нарушен механизм защиты CpG-островков от метилирования. Кроме того, недавно было показано, что Dnmt1 является мишенью действия онкобелков Ras и Fos, то есть активность фермента регулируется внутриклеточными путями, передающими митогенные сигналы (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001).
Гиперметилирование CpG-островков приводит к стабильной инактивации прилежащего гена, то есть феномену MAGI (methylation-associated gene inactivation). Это происходит в результате возникновения стерических препятствий к связыванию транскрипционных факторов или гетерохроматинизации, опосредованной метилцитозин-связывающими белками MBD (Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Если прилежащим геном окажется ген домашнего хозяйства, то его инактивация будет летальна для клетки, но не будет иметь особых последствий для организма. Подавление экспрессии какого-либо из тканеспецифических генов нанесет определенный ущерб дифференциальному фенотипу клетки, не оказывая влияния на общую жизнеспособность. В то же время, инактивация гена супрессора опухолевого роста или гена репарации может создать условия для неконтролируемой пролиферации (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Аберрантное метилирование CpG-островков является ранним событием в процессе возникновения опухоли. Например, гиперметилирование промоторного региона гена супрессора опухолевого роста p16INK4A при плоскоклеточном раке легкого было обнаружено уже в гиперплазии (Baylin S.B., et al, 1998).
Ген ретинобластомы (Rb1) - первый классический ген супрессор опухолевого роста, в отношении которого был установлен феномен MAGI. Важность этого гена определяется тем, что, как полагают, все (или почти все) антипролиферативные сигналы реализуются в клетке опосредованно, через белок Rb или родственные белки (Hanahan D. & Weinberg R.A., 2000). Белок Rb синтезируется на протяжении всего клеточного цикла и почти все время присутствует в неполностью фосфорилированном виде. Такая форма белка способна связывать факторы, отвечающие за переход клетки из фазы G1 в фазу S, т.е. принимает участие в негативной регуляции клеточного цикла (Kouzarides T., 1995). Когда белок Rb фосфорилируется с помощью специфичных для клеточного цикла киназ (например, циклином D1/CDK4), связанные с ним эффекторы высвобождаются и запускают переход в S-фазу.
Сама по себе, ретинобластома представляет собой опухоль, развивающуюся из эмбриональной сетчатки и наследуемую в большинстве случаев по аутосомно-доминантному типу с 90%-ной пенетрантностью. Кроме семейных случаев возникновения ретинобластомы описаны и спорадические случаи (Киселев Ф.Л., 1998). Гиперметилирование CpG-островка промотора гена Rb1 имеет место только при спорадической (унилатеральной) ретинобластоме в 10-15% случаев (Hanahan D. & Weinberg R.A., 2000). К настоящему времени известно значительное число генов супрессоров опухолевого роста, инактивированных в различных опухолях путем гипеметилирования CpG-островков, локализованных в их регуляторных областях. Среди них: гены Rb1, р53, VHL, BRCA1, MLH1 и другие (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001; Robertson K.D. & Jones P.A., 2000; Hanahan D. & Weinberg R.A., 2000; Киселев Ф.Л., 1998).
3. 5-МеС как эндогенный мутаген.
5-МеС может подвергаться спонтанному дезаминированию даже при обычных условиях тепловых флуктуаций, что делает CpG сайты "горячими точками" для возникновения мутаций. CpG динуклеотиды, расположенные в кодирующих регионах генов супрессоров опухолевого роста могут спровоцировать мутации, приводящие к возникновению опухоли (Rideout W.M.I., et al, 1990). О серьезности этого феномена свидетельствует то обстоятельство, что из 300 мутаций гена р53, главного хранителя целостности генома, зарегистрированных в опухолях человека различной локализации, 25-30% относятся к мутациям этого типа или эпимутациям (Greenblatt M.S., et al, 1994).
Увеличение мутабельности 5-МеС может быть обусловлено тремя факторами: различной эффективностью репарации, скоростью спонтанного дезаминирования и скоростью деления клеток (Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Дезаминирование 5-МеС приводит к образованию тимина, такого же естественного основания ДНК, как и другие, и поэтому возможны ошибки системы репарации. Серьезность проблемы состоит в том, что замены нуклеотидов возникают довольно часто. Согласно расчетам, за сутки в каждой клетке происходит ~100 реакций дезаминирования, из которых многие приводят к мутациям (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Что касается третьего фактора, то оказалось, что связанные с CpG мутации быстрее происходят в поврежденных тканях в процессе восстановления (Greenblatt M.S., et al, 1994).
Заключение.
Характерной чертой опухолевых и трансформированных in vitro клеток млекопитающих является дисбаланс метилирования геномной ДНК, который вносит значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности. В тоже время, нестабильность 5-МеС в составе CpG динуклеотидов, приводящая к эпимутациям, может иметь тот же конечный результат. Таким образом, метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь между генетическими и эпигенетическими процессами при возникновении и развитии опухоли.
Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих. С медицинской точки зрения это открывает возможности для ранней диагностики и лечения заболевания. Тем более, что в отличие от мутаций, которые принципиально необратимы, модификации ДНК, хотя и весьма стабильны, но принципиально обратимы.