Моноциты. Мононуклеарные фагоциты (макрофаги) в процессе развития проходят три стадии: костномозговую (монобласт, промоноцит); циркулирующую (моноцит) и тканевую (макрофаг, многоядерная гигантская клетка). Циркулирующие моноциты обладают практически всеми свойствами присущими макрофагам и являются главными действующими лицами в реализации иммунного воспаления, составляющего основу ГЗТ. Таким образом, моноцитоз при наличии клинических признаков аллергического заболевания свидетельствует в пользу ГЗТ.
CD4. Это преимущественно хелперная субпопуляция лимфоцитов. Увеличение этой фракции наблюдается как при ГНТ, так и при ГЗТ. В свете представлен-
ных данных о роли Тх2 и Тх1 в ГНТ и ГЗТ, наибольшую диагностическую ценность представляет определение доминирования Тх2 или Тх1 в суммарной субпопуляции CD4 клеток. Существенную помощь в этом может оказать определение секреторных маркеров Тх1 (ИЛ-2, ИФгамма) и Тх2 (ИЛ-4, ИЛ-5). Таким образом, повышение уровня ИЛ-2 и ИФгамма в сочетании с определением CD4 будет свидетельствовать в пользу ГЗТ; повышение уровня ИЛ-4 и ИЛ-5 в сочетании с CD4 будет свидетельствовать в пользу ГНТ. Дополнительную информацию может дать определение ИЛ-12, ФНОальфа и ФНОбета, повышенное содержание которых индуцирует дифференцировку CD4 в сторону Тх1 (ГЗТ).
CD8. Вначале клетки с этими рецепторами относили к супрессорам. В настоящее время установлен их преимущественно цитотоксический эффект (Т-киллеры), однако им присущ и супрессорный эффект. В частности, эти клетки вырабатывают фактор с молекулярной массой 30000, который подавляет выработку IgE. Таким образом, уменьшение количества CD8 клеток является фактором риска аллергических заболеваний, связанных с ГНТ, а при наличии
клинических признаков, свидетельствуют в пользу ГНТ.
CD20. Клетки, идентифицируемые этим маркером относятся к Б-лимфоцитам. При наличии клинических признаков аллергии увеличение CD20 свидетельствует больше в пользу ГНТ. Однако наибольшую ценность имеет совместное определение CD20 и CD23 клеток, поскольку CD23-клетки продуцируют факторы молекулярной массой 60000 и 15000 усиливающие выработку IgE. Вместе с тем, не фиксированный на поверхности клеток рецептор CD23 (растворимая форма) взаимодействуя с рецепторным комплексом Б-клеток, в частности с CD19, запускает сигнал к усилению пролиферации IgE+-Б-клеток и секреции ими IgE. Таким образом, определение CD23-клеток и, особенно, растворимой формы CD23 рецептора могут играть существенную роль в диагностике ГНТ, однако в настоящее время эти показатели не могут быть использованы в широкой клинической практике, поскольку в таком аспекте они еще не прошли клиническую апробацию.
IgE. Известно, что этот иммуноглобулин является главным действующим лицом в ГНТ. При определении IgE различают общее его содержание и специфический IgE (к конкретному антигену). В данном разделе речь пойдет об общем IgE. Повышение уровня IgE свидетельство наличия ГНТ, однако не всегда указывает на наличие аллергического заболевания, поскольку ГНТ, как уже говорилось, является защитной реакцией. В своем руководстве для практических врачей
Л. Йегер (1990) приводит диагностические ориентиры вероятности развития аллергических заболеваний в зависимости от уровня IgE. В таблице 1 представлены эти данные.
Существенную помощь может оказать также определение IgE в секретах.
IgA. Этот иммуноглобулин также как и IgE секретируется преимущественно в слизистых. Отмечены антагонистические взаимоотношения IgA и IgE. Снижение уровня IgA сопровождается компенсаторным увеличением уровня IgE.
Возможен еще один механизм этого антагонизма - дефицит IgA служит
причиной усиления проницаемость слизистой способствующей проникнове-
нию аллергена. Таким образом, снижение уровня IgA служит косвенным признаком увеличения IgE и доминированием ГНТ при наличии клинических признаков аллергического заболевания. Снижение уровня IgA у здоровых лиц может служить критерием отнесения в группу риска развития аллергических заболеваний. Желательно одновременное определение величин IgA и IgE, поскольку сочетание повышенного уровня IgE со сниженным уровнем IgA гораздо более надежно, чем каждый из этих тестов в раздельности свидетельствует в пользу ГНТ.
Таблица 1.
Прогностическая роль определения уровня IgE у детей и взрослых
(по Humburger).
Возраст
Уровень IgE в МЕ/л
Вероятность развития аллергических заболеваний в %.
До 2-х недель
< 0,5
12
> 0,5
45
До 3-х лет
6
5
6 - 15
20
16 - 60
35
> 60
~100
Дети и взрослые
60
8
61- 210
22
211- 450
39
> 450
~100
IgG. Уже упоминалось о том, что уровень IgG, особенно IgG4 конкурирует с IgE по отношению к аллергену (блокирующие антитела) на чем, собственно, и основана специфическая иммунотерапия (СИТ). С одной стороны, этот факт позволяет использовать снижение IgG для определения роли ГНТ при наличии клинических признаков аллергических заболеваний и при сочетанном снижении IgA и IgG отнести здоровых лиц с подобными изменениями в группу риска развития аллергических заболеваний; с другой стороны - повышение уровня IgG в процессе СИТ позволяет прогнозировать ее эффективность.
Мы представили клиническую характеристику иммунологических тестов, наиболее приемлемых с нашей точки зрения для патогенетической диагностики аллергических заболеваний, однако следует подчеркнуть, что каждый из них имеет ограниченное диагностическое значение и поэтому их надо использовать в комплексе. В таблице 2 представлен вариант комплексной оценки с точки
зрения дифференциальной диагностики ГНТ и ГЗТ.
Одновременное изучение этих параметров и выявление указанных в таблице сдвигов позволяет достаточно надежно установить приоритет ГНТ или ГЗТ в патогенезе аллергического заболевания и назначить корректную терапию.
С точки зрения выделения групп риска аллергических заболеваний и с
учетом трудоемкости и доступности лабораторных тестов мы предлагаем опре-
деление количества эозинофилов, базофилов, моноцитов, IgA, IgG, IgE.
3.2.2. Биохимическая патогенетическая диагностика.
Она, прежде всего, связана с определением уровня БАВ и имеет значение преимущественно для диагностики ГНТ. В идеале желательно определение основных БАВ, участвующих в реализации ГНТ (гистамин, серотонин, брадикинин, медленно реагирующая субстанция и др.), однако в реальной жизни это достаточно трудоемкие и дорогие исследования, используемые в настоящее время преимущественно для исследовательских целей. Поэтому, как и раньше, основное место в патохимической патогенетической диагностике принадлежит гистамину. Ориентиром в диагностике может быть повышенное содержание гистамина в крови. Однако наиболее оправданным как с диагностических, так и с экономических точек зрения является определение ряда феноменов связанных с гистамином.
Таблица 2.
Дифференциальная диагностика ГНТ и ГЗТ на основании комплексной оценки иммунологических тестов.
Иммунологические тесты
ГНТ
ГЗТ
Количество эозинофилов
?
Количество базофилов
??????
Количество моноцитов
?
CD4
??
?
CD8
?
CD20
?
??
CD23
?
IgA
?
IgE
?
IgG
?
IgG4
?
ИЛ-2
?
ИЛ-4
?
ИЛ-5
?
ИЛ-12
?
ИФ-гамма
?
ФНО-альфа
?
ФНО-бета
?
? - повышение показателя
??- снижение показателя
В 1952 г. Parrot и Urquia выявили способность сыворотки крови здоровых людей связывать свободный гистамин и назвали это свойство гистаминопексией. Ими был предложен способ количественного учета этого явления, названный ими гистаминопексическим индексом (ГПИ) и установлено, что снижение ГПИ ниже 30% свидетельствует о наличии аллергического состояния. В дальнейшем их данные были подтверждены многочисленными исследователями и ГПИ стал широко использоваться в диагностике аллергических заболеваний.
В 1961 г. Mikol, Renoux, Merklen открыли антигистаминовый фактор (АГФ), который отражал еще одну сторону связывания сывороткой крови гистамина, поскольку гистаминопексическая способность сыворотки терялась при нагревании в течении двух часов при температуре 56оС; в то время как способность сыворотки крови агглютинировать нагруженные гистамином частички латекса, лежащая в основе определения АГФ, полностью сохранялась. Титр АГФ ниже 1/160 был характерен для аллергических заболеваний.
В настоящее время эти два параметра патохимической патогенетической диагностики ГПИ и АГФ незаслуженно забыты, и мы сочли необходимым привести детальное описание методики их определения.
Гистаминопексический индекс (ГПИ).
Принцип метода: к диализированной (для удаления свободного гистамина) сыворотке крови добавляют известную концентрацию гистамина. В опытную пробирку гистамин добавляют до осаждения белков трихлоруксусной кислотой (ТХУК); в контрольную - после осаждения. Сравнивают экстинкцию опыта и контроля на спектрофотометре. Разность между экстинкциями, выраженная в процентах позволяет учесть процент связывания гистамина сывороткой крови.
Реактивы: физиологический раствор, 5% ТХУК, эфир, 0,01% раствор гистамина, 5Н серная кислота, 4% раствор азотнокислого натрия, 25% раствор Na2CO3, 0,5Н раствор едкого натра, 10% раствор азотнокислого натрия, раствор сульфаниловой кислоты (0,9 г. сульфаниловой кислоты растворяют в смеси 9,0 концентрированной соляной кислоты и 100,0 бидистиллированной воды).
Диализ: 0,5 мл. сыворотки крови помещают в целлофановый мешочек, который погружают в 0,5 литровую колбу с физиологическим раствором. Диализ длится 24 часа с трехкратной сменой физиологического раствора.
Ход реакции: диализированную и разведенную в 20 раз сыворотку разливают по 2,0 мл в 2 пробирки (контроль и опыт). В первую пробирку добавляют 0,25 мл 0,01% раствора гистамина, выдерживают при комнатной температуре 3 минуты, затем в обе пробирки прибавляют 2,25 мл 5% ТХУК. После 30 минут стояния обе пробирки центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно переливают в чистые сухие пробирки, в контрольную пробирку добавляют 0,25 мл 0,01% раствора гистамина и обе пробы подкисляют 0,15 мл 5Н серной кислоты, затем экстрагируют эфиром (3 раза по 3,0 мл) в делительной воронке. По 2,0 мл водной фракции переносят в чистые сухие пробирки (сохраняя нумерацию пробы и контроля), добавляют по 1,0 мл 4% раствора азотнокислого натрия и помещают в кипящую водяную баню на 3 минуты, затем охлаждают 5 минут на льду. К этому времени нужно приготовить диазореактив: к 1,25 мл охлажденного на льду 10% раствора азотнокислого натрия прибавляют 0,5 мл сульфаниловой кислоты и доводят до 10,0 мл бидистиллированной водой. После охлаждения в обе пробы добавляют 1,0 мл диазореактива и 1,75 мл 25% раствора углекислого натрия; через 1 минуту добавляют 0,3 мл 0,5Н раствора едкого натра. Экстинкцию полученного раствора розового цвета тотчас же измеряют спектрофотометрически при длине волны 484 миллимикрон. Сравнивают экстинкции опыта и контроля. Экстинкция контроля должна быть выше опыта. Одинаковые величины наблюдаются при нулевой гистаминопексии. Расчитывают по формуле: ГПИ= (К - О): К*100, где К - экстинкция контроля; О - экстинкция опыта.