2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и О137:К79 Е. coli.Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.
Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.
Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение сыворотки 1:10.
Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа, в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных (коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).
Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела, а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.
Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем через бактериальный фильтр Зейтца.
2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.
С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра сыворотки. Контроли обычные.
Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через 24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.
2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами (серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli).
Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.
После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали, затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный результат.
Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая агглютинация, оцениваемая в четыре креста.
2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора: 4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г х. ч. Nа2НРО4×12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера 6,2.
Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и выдерживали 25-30 мин.
Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема. Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5 мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения однородной взвеси.
Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы подучить толщину слоя 4 мм.
После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга. Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин. Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную лунку в объеме 0,05 мл.
Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05 каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.
Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали 48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).
После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом.
Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах, откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.
Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм. На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5 мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили 1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5×10=25 мкг/мл. Так как, литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600 ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки молозива равнялась 20,6×25 =515,0 ед/мл.
2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.
Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных. Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2×6Н2О г + 6 г CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой (1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л дистиллированной воды и фильтровали.
Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания. Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.
Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.
| 1:1000 | 1:1200 | 1:1500 | 1:2000 | 1:2500 | 1:3000 | 1:3500 | 1:4000 | |
| Буфер, мл | 0,9 | 1,1 | 1. 4 | 1,9 | 2,4 | 2,9 | 3,4 | 3,9 |
| Гемолизин | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5 % взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для сенсибилизации эритроцитов барана.