Фотодинамическое цитотоксическое действие МС было известно многие годы (2). Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивации МС-чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие её ультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5 минут), докладывалось, что ультраструктурные изменения были идентичны данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признаки повреждения плазматических мембран) , а высокая продолжительность иллюминации вела к разрыву мембран клеточной фрагментации. В исследования фотодинамического действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК, вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации в МС присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологические эжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.
Роль ИКК в генерации медленных волн.
Настоящее исследование подкрепляет гипотезу о том, что ИКК незаменимы для генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобных исследованиях, использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после инкубации в МС (36). Было показано, что активность медленных волн поражается в препаратах где ИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не окрашивается. В другом исследовании (37), спонтанная сократительная активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемых кусочках мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотрены под микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становились неподвижными при сильном освещении.
Настоящее исследованиеспецифически устанавливает решающую роль ИКК в генерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде (12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая внутриклеточная активность периодически активирует токи водителя ритма. В этом случае ИКК могут являться или биохимическими часами или одновременно биохимическими часами и ионными каналами, отвечающими за генерацию тока водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК (25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторами кальциевых каналов L-типа и следовательно не отражают медленные волны, как компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами не устраняются (14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеют характеристик медленных волн.
Следующий вопрос касается роли ГМК в генерации медленных волн, как компонента водителя ритма. Ветвистые ГМК, которые интимно соединяютс с ИКК соединительными щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственные за генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должна генерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высоким сопротивлением поверхности, должна быть огромной. Возможно и другое: ИКК – это биохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты через соединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такой метаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии с ИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК – активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналов водителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК. Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2и карбохола, изолированный слой ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК генерирует потенциалы действия, которые идентичны по частоте с медленными волнами, но устраняются блокаторами кальциевых каналов L-типа (D-600) (18). Это и последующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активности медленных волн.
Активность медленных волн также исчезает после обработки тканей Родалином 123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфический маркёр митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особенно богаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123 становится цитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно, эффект Родолина 123 наводит на мысль о том, что активность медленных волн находится в строгой зависимости от внутриклеточного метаболизма. Это согласуется с наблюдениями о том, что активность медленных волн чувствительна к высоким температурам (1), блокируется ингибиторами метаболизма, такими как динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis и J.D. Huizing, неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий (настоящее исследование). Это поддерживает гипотезу авторов о том, что компонент медленных волн водителя ритма образуется благодаря внутриклеточному метаболизму.
Таблицы, графики и изображения.
Таблица 1.Эффекты инкубации в 50 мМ метиленового синего (45 минут) на электрическую активность препаратов ИКК-ЦМ с или без иллюминации
| Параметры | В растворе Кребса | +Метиленовый синий | +Свет |
| Мембранный потенциал покоя, мВ | -72,8+-0,8 | -70,6+-0,9 | -47,3+-1,9 -69,7+-1,6 |
Частота, циклов/минуту | 5,3+-0,2 | 5,0+-0,2 | |
| Продолжительность, с Амплитуда действия, мВ | 3,8+-0,3 38,6+-1,4 | 4,9+-0,7 37,4+-1,5 | |
| Амплитуда плато, мВ | 34,1+-1,3 | 33,2+-1,6 | |
| Частота колебаний, мВ/c | 192,3+-23,8 | 169,4+-18,7 |
График 1.Электрофизиологические эффекты иллюминации на окрашенные МС препараты ИКК-ЦМ.
А: МС (45 минутная инкубация) немного снижает мембранный потенциал покоя и увеличивает продолжительность медленных волн. Эти эффекты исчезают после промывки препаратов от МС в растворе Кребса в течении 5 минут. Препарты затем освещались с максимальной интенсивностью. В последующем, амплитуда медленных волн снижалась при этом мембранный потенциал покоя уменьшался до –44мВ. Реполяризация мембран не востанавливала активность медленных волн, что указывает на то, что устранение медленных волн является следствием ингибирования механизма генерирования медленных волн и не вызвана деполяризацией.
В: Уменьшение интесивности света на 1/3 от того, что было в опыте А значительно удлиняет период иллюминации, требуемый для устранения медленных волн. В этом эксперименте наблюдались медленные волны большей продолжительности во время периода деполяризации. Медленные волны устранялись при величине мембранного потенциала покоя –42 мВ.
График 2. Эффекты мембранного потенциала на активность медленных волн.
А: после 45 минутной инкубации в МС и промывки в растворе Кребса, препараты освещались с 1/3 максимума интенсивности до тех пор пока амплитуда медленных волн не станет равна половине таковой в растворе Кребса. Препараты были реполяризованы к такому же мембранному потенциалу покоя как и в растворе Кребса. В данном случае восстановления амплитуды медленных волн не наблюдалось.
В: в противоположность этому, в случае когда деполяризация была вызвана повышением внеклеточной концентрации К+ до 15 мМ в растворе глюкамин-нитрендипин-Кребса, реполяризация препаратов ИКК-ЦМ с использованием метода анологичному в опыте А полностью восстанавливала амплитуду медленных волн. Кроме того, амплитуда медленных волн также восстанавливалась после промывки.
Таблица 3. Устранение активности медленных волн МС+свет без заметной деполяризации. Медленные волны устранялись в МС окрашенных препаратах ИКК-ЦМ с освещением 1/3 максимума интесивности света на протяжении 8,5 минут. Медленные волны Медленные волны устранялись при величине потенциала –64 мВ, что равно истинной величине мембранного потенциала покоя препаратов циркулярных мышц в растворе Кребса. (см. График 4)
Таблица 4. Электрофизиологические эффекты МС+свет на препараты ЦМ. Препараты ЦМ, лишённые подмышечной сети ИКК и нескольких прилежащих слоёв ГМК были спонтанно помежены в раствор Кребса. Инкубация в 50 мМ МС не вызвала изменений мембранного потенциала, чего не сделала и 3 минутная иллюминация с максимумом интенсивности. Было показано, что препараты ЦМ жизнеспособны при стимуляции 0,5 мМ BaCl2 + 0,1 BAY K 8644.
Изображение 5.
А: электронная микрофотография подслизистого края в контрольной ткани. Иллюминация с максимальной интенсивностью в течении 10 минут без преинкубации в МС не имеет эффектов на ультраструктуру ИКК ( митохондрии не конденсированы), тонкие нерегулярные ветвистые гладкомышечные клетки (ВГМК), нервы (Н) и собственно циркулярные мышцы (ЦМ).
SUB: подслизистая
В и С: обратите внимание, ИКК после инкубации в МС в течении 45 минут, без последующей иллюминации (В) или с 2 минутной иллюминацией с максимумом интенсивности (С) претерпели изменение конформации митохондрий от конденсированной в ортодоксальную. В отличие от этого, ультраструктура сохранена, включая щелевые контакты (ЩК).