• Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3—5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят perrectum на глубину 5—6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае — в транспортную среду.
• Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3—5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
• Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
• Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20—50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами — лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
• Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
• Промывные воды бронхов. При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
• Отделяемое глотки, ротовой полости и носа. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют, т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае рекон-валесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.
Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.
Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред, а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.
3.3 Вирусологический метод
Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалами могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.
Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адено-, рео- и ротавирусы.
Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности', например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментно заражать 3—4 культуры клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чаще всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.
Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции.
3.4 Биологический метод
Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.
Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.
3.5 Иммунологический метод
Иммунологический метод (серологический) включает исследования сыворотки крови, а также других биологических субстратов для выявления специфических антител и антигенов. Классическая серодиагностика основана на определении антител к выявленному или предполагаемому возбудителю. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке крови антител к антигенам возбудителя, отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Обнаружения в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета, поэтому исследуют «парные» сыворотки крови, первую, взятую в первые дни болезни, и вторую, взятую с интервалом 7—10 дней. В этом случае оценивают динамику нарастания уровня антител.
Диагностически значимо увеличение титра антител в исследуемой сыворотке крови не менее чем в 4 раза относительно первоначального уровня. Этот феномен называют сероконверсией. При редких инфекционных болезнях, а также вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции и некоторых других факт наличия антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.