Роль карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в гемостазе у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде (стр. 6 из 8)
Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.
2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента
Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [62]. Пробы колориметрировали на КФК-2 при l=590 нм. Активность АПФ определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Концентрацию белка определяли биуретовым методом.
2.2.3 Метод определения содержания белка
Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Принцип метода основан на том, что ионы меди в щелочной среде взаимодействуют с пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации общего белка.
Опытные пробы содержали 50 мкл сыворотки крови и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента (концентрат биуретового реагента развести дистиллированной водой в соотношении 1:19). Контрольные пробы содержали 50 мкл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента. В калибровочную пробу добавляли 50 мкл калибровочного раствора общего белка (раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60 г/л с добавлением хлористого натрия 9 г/л и азида натрия 1 г/л).
Содержимое пробирок тщательно перемешивали, избегая образования пены, инкубировали при комнатной температуре (+ 18 - 25
С) в течение 30 минут, после чего измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм.Концентрацию общего белка рассчитывали, как отношение оптической плотности опытной пробы к оптической плотности калибровочной пробы умноженная на концентрацию общего белка в калибровочном растворе (60 г/л).
2.3 Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [16, 29, 40]. Корреляционный анализ проводили с помощью программы «Статистика» (версия 6.0).
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Исследование активности карбоксипептидазы Nв сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде
Результаты исследования показали увеличение активности КПN в сыворотке крови онкологических больных торакального и абдоминального отделения в ранний послеоперационный период по сравнению с пациентами урологического отделения (рис. 1).
Рис. 1. Активность КПN у онкологических больных в ранний послеоперационный период (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M±m, n=12¸18; достоверность отличий: ** – р < 0,01, *** – р < 0,001 относительно урологической группы).
КПNлокализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов. Легкие, желудочно-кишечный тракт имеют обширную капиллярную систему, после операции происходит повреждение этой системы, и вероятно, выход фермента в кровяное русло, что в итоге приводит к увеличению его активности [60].
При проведении корреляционного анализа (табл. 3), была выявлена отрицательная взаимосвязь между активностью КПN и ХЗФ у больных абдоминального отделения. В процессе свертывания крови калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген до активного кинина, который повышает чувствительность фактора XI к действию фактора XIIа [48]. Известно, что КПN участвует в деградации брадикинина [74], вероятно, увеличение активности этого фермента у данной группы больных может способствовать уменьшению свертывания крови по внутреннему пути. Кроме того, фактор Хагемана может включаться в фибринолиз, снижая время лизиса фибринового сгустка.
Обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между активностью КПN и уровнем фибриногена у пациентов урологического отделения. Фибриноген относится к острофазным белкам, концентрация которого резко возрастает в послеоперационный период, что усиливает тромбообразование на данном этапе [8]. Этот белок определяет вязкость плазмы крови, повышает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. Под действием тромбина из фибриногена образуются фибрин-мономеры, из которых впоследствии образуются фибриновый сгусток. Чрезмерное увеличение фибриногена может приводить к повышенному тромбообразованию. КПN, участвуя в инактивации брадикинина, вероятно, сдерживает активацию свертывания крови по внутреннему пути, тем самым способствуя поддержанию фибриногена на нормальном уровне у данной группы больных.
Таблица 3 Корреляционные взаимосвязи параметров гемостаза и карбоксипептидазы N
| Параметры гемостаза | Активность КПN | ||
| Абдоминальнаягруппа | Торакальнаягруппа | Урологическая группа | |
| КПN | 1,00 | 1,00 | 1,0 |
| АПФ | -0,7 | 0,23 | 0,19 |
| Тромбоциты | 1,00 | -0,43 | -0,27 |
| Время свертывания по Ли-Уайту | 0,60 | 0,37 | -0,20 |
| АПТВ | 0,23 | -0,15 | 0,62 |
| Протромбин | 0,19 | 0,03 | 0,35 |
| Тромбиновое время | -0,78 | 0,17 | 0,38 |
| Растворимый фибрин-мономерный комплекс | 0,78 | -0,13 | -0,64 |
| Фибриноген | 0,82 | 0,11 | 0,96* |
| Хагеман-зависимый фибринолиз | -0,98* | 0,08 | 0,97* |
Достоверность корреляционных взаимосвязей: *– р < 0,05.
Обнаружена также положительная корреляция между активностью КПNи ХЗФ у больных урологического отделения. Известно, что в почечной ткани вырабатывается большое количество активаторов плазминогена. После оперативных вмешательств, особенно по поводу удаления опухолей, в кровь выделяется большое количество компонентов фибринолиза [44]. Вероятно, в данных условиях активность КПN может быть снижена, чтобы сдерживать антикоагуляционные процессы.
3.2 Исследование активности ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде
Результаты исследования показали достоверное увеличение активности АПФ в сыворотке крови онкологических больных урологического отделения по сравнению с пациентами абдоминального и торакального отделения (рис.2).
Рис. 2. Активность АПФ у онкологических больных в ранний послеоперационный период (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M±m, n=12¸18; достоверность отличий * – р < 0,05, ** – р < 0,01 относительно урологической группы).
АПФ – мембранно-связанный фермент, локализованный преимущественно в тканях почек. Этот фермент является компонентом ренин – ангиотензиновой системы [4, 48]. При повреждении почек, в том числе и хирургического вмешательства, происходит высвобождение АПФ в кровоток, что приводит к увеличению активности фермента.
При проведении корреляционного анализа (табл. 4) была обнаружена отрицательная корреляционная взаимосвязь между активностью АПФ и уровнем РФМК у пациентов абдоминального отделения. У больных, страдающих онкологическим заболеванием, антитромбогенная активность стенок сосудов в процессе роста опухоли снижается, а в раннем послеоперационном периоде обнаруживается повышенная склонность к внутрисосудистому свертыванию крови и тромбообразованию [8, 11, 19, 34, 35].Известно так же, что в эндотелии содержится большое количество активатора плазминогена. Эндотелиальная дисфункция способствует уменьшению этого процесса, что вызывает сдвиг в системе антикоагуляция-коагуляция с преобладанием последней [73]. Участие АПФ в регуляции сосудистого тонуса реализуется через синтез ангиотензина-II, оказывающего мощное вазоконстрикторное действие. Другой механизм, более сопряженный с собственно эндотелиальной дисфункцией, связан со способностью АПФ ускорять деградацию брадикинина. АнгиотензинII является вазопрессором, стимулятором образования свободных радикалов, в частности, супероксидных анионов, которые инактивируют NO, промотируют образование пероксинитрита и снижают эффективность NO-опосредуемой сосудистой дилатации. Т.о., ангиотензин II, способствует развитию эндотелиальной дисфункции, в результате чего усиливается выработка вазоконстрикторов и прокоагулянтов [48]. В результате активируется система свертывания, компонентом которой является РФМК. В то время как брадикинин стимулирует синтез NO в эндотелии, участвуя в дилатациисосудовиусиливаяскоростьместногокровотока. Вероятно,
Таблица 4 Корреляционные взаимосвязи параметров гемостаза и ангиотензинпревращающего фермента
| Параметры гемостаза | Активность АПФ | ||
| Абдоминальнаягруппа | Торакальнаягруппа | Урологическаягруппа | |
| КПN | -0,7 | 0,23 | 0,19 |
| АПФ | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Тромбоциты | -0,72 | 0,55 | -0,45 |
| Время свертывания по Ли-Уайту | -0,92 | -0,20 | -0,31 |
| АПТВ | -0,54 | 0,24 | 0,78 |
| Протромбин | 0,41 | 0,71* | 0,48 |
| Тромбиновое время | 0,89 | 0,00 | 0,77 |
| Растворимый фибрин-мономерный комплекс | -0,99** | -0,39 | -0,73 |
| Фибриноген | 0,87 | 0,22 | 0,01 |
| Хагеман-зависимый фибринолиз | 0,81 | -0,10 | 0,18 |
Достоверность корреляционных взаимосвязей: *– р < 0,05, ** – р < 0,01. Снижение активности АПФ является компенсаторным механизмом в условиях имеющейся гиперкоагуляции.