Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию (стр. 7 из 13)
3.6 Иммунноэлектронная микроскопия
Ткань печени и сердца фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегид/0.05% глутаровый альдегид в PBS – буфере (16.7 мМ Na2HPO4· 12 H2O, 3.3 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, рН 7,4) в течение 4 ч при 4°С. Обезвоживание в спиртах и пропитку образца смолой LR-White (Sigma, USA) проводили при 4°С. Полимеризацию смолы осуществляли под ультрафиолетом в течение 48 часов при комнатной температуре. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме UC6 (Leica, Германия) и помещали на золотые сеточки, покрытые формваровой пленкой и укрепленные углем (Agar). Неспецифическое окрашивание блокировали обработкой раствором, содержащим 3% БСА и 0.5% желатина в течение 1ч. Все дальнейшие процедуры проводили в PBS содержащем 1% БСА и 0.01% тритон Х-100. После каждой инкубации образцы отмывали PBS- буфером, содержащим 0.1% тритон Х-100 и 0.1% глицин и затем в растворе БСА и желатина в течение 20 мин [18]. В качестве первичных антител были использованы полученные нами антитела к митохондриальному К+-транспортирующему белку (в разведении 1:100), инкубацию с которыми проводили в течение ночи при 4°С. После тщательной отмывки сеточки с образцами помещали на каплю вторичных антител, меченных коллоидным золотом с размером гранул 10 нм (Anti-RabbitIgG, Sigma, USA) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После отмывки образцы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом Tesla BS-500 (Чехословакия). Специфичность метода проверяли заменой первичных антител на буфер.
3.7 MS-MALDI-TOF/TOF- анализ
MS-MALDI-TOF/TOF- анализ был выполнен на базе ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича. Очищенный митохондриальный К+-транспортирующий белок подвергали ферментативному гидролизу трипсином в денатурирующих условиях в геле. Пептидную смесь из геля экстрагировали ацетонитрил/гидрокарбонат аммонием и затем проводили масс-спектральный анализ на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Daltonik) в режиме моноизотопической детекции 300-1800 Да. Масс-спектры анализировались через базу данных MSDC и NCBI программой Mascot (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
3.8 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа
Для выделения из антисыворотки, содержащей специфические антитела, фракции иммуноглобулинов, использовали методы дробного высаливания, хроматографии и диализа [Антитела. Методы. Изд-во «Мир», 1991, т.1, с.106-107].
Антисыворотку перед высаливанием разводили в 2 раза раствором 0.9% NaCl (рН 7.5). К полученному объему антисыворотки добавляли половинный объем холодного насыщенного раствора сульфата аммония при перемешивании на ледяной бане. Смесь оставляли на 30 минут и затем центрифугировали 20 минут при 5000 g. Осадок растворяли в 0.9% NaCl (рН 7.5). Эту процедуру повторяли 2 раза. Окончательно осадок растворяли в 0.01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7.5), содержащем 0.15 М NaCl и диализовали против этого же буфера в течение 18 часов при 4°С. Нерастворившийся осадок удаляли центрифугированием (20000 g, 10 минут).
Надосадочную фракцию наносили на колонку (объем 5 см3, диаметр – 1 см, h = 5 см), заполненную ДЭАЭ-целлюлозой (Sigma) и уравновешенную 0.01 М Na-фосфатным буфером (рН 7.5). Элюирование иммунноглобулинов G (IgG) проводили двойным объемом ступенчатого градиента NaCl: 50, 100, 150, 200 мМ. IgG элюировались 50 мМ NaCl. Фракции, содержащие IgG, объединяли и концентрировали с помощью ПЭГ-20000. Полученную фракцию диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5) в течение ночи при 4°С. Контроль чистоты фракции IgG осуществляли с помощью SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1979].
3.9 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным Белком А
Перед очисткой иммуноглобулинов в имеющейся сыворотке измеряли концентрацию белка на спектрофотометре ShimadzuUV-2401 РС (Япония) при длине волны 280 нм. Сыворотку разводили 0.1М Na-фосфатным буфером, pH 7.0 до концентрации белка ~2 мг/мл. Разведенную сыворотку, из расчета 20 мг общего белка, наносили на колонку объемом 1 мл, упакованную конъюгированной с белком A (Amersham, Sigma, USA). После нанесения сыворотки колонку промывали тем же буфером до полного отсутствия белка в элюате. Наличие белка в элюате регистрировали при помощи UvicordS-IILKB (Швеция).
IgG элюировали с колонки 0.1М Na-цитратным буфером, pH 3.0. Элюат немедленно титровали 1М Трис-HCl, pH 9.0 до pH 7.0. Затем колонку отмывали 0.1 М Na-фосфатным буфером до pH 7.0.
Концентрацию белка в элюате измеряли на спектрофотометре ShimadzuUV-2401 РС (Япония) при длине волны 280 нм. Чистота IgG проверялась при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли [16]. Очищенные IgG разводили глицерином в соотношении 1:1 и хранили при температуре -20ºС.
3.10 Ингибиторный анализ с использованием антител к белку
с м.м. 55 кДа
Анализ влияния специфических к белку с м.м. 55 кДа антител на параметры функционирования митоКАТФ канала проводили, во-первых, с использованием К+-селективного электрода, определяя скорость ДНФ-индуцированного выхода К+из МХ и концентрацию ионов К+ в матриксе МХ (см. п.п. 3.2.). Во-вторых, с помощью определения энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии (см. п.п. 3.1.). При проведении ингибиторного анализа в качестве контроля использовалась преимунная сыворотка, а также сыворотка, содержащая специфические антитела на белок с м.м. 55 кДа, подвергнутая предварительно 5-тиминутному кипячению. Также определялось влияние антител на процесс дыхания МХ.
Глава 4. Выделение комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс
Для выделения комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени использовали самцов крыс альбиносов линии Вистар, массой ~250г. Крыс умерщвляли декапитацией без наркоза. Печень извлекали и помещали в предварительно взвешенную среду выделения (t 0°С). После определения массы и проведения перфузии 0.9% NaCl, печень продавливали через пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения, отнесенном к исходному весу ткани.
Сначала осаждали МХ дифференциальным центрифугированием, супернатант центрифугировали на 105000 g 1 час, получившийся осадок наносили на градиент (20, 25, 30, 35% сахароза) крутили 105000g 1 час.
Происходило разделение образца на две четкие зоны, 25-30% микросомы, 20% мембраны.
4.1 Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных
Схема, по которой животные тестировались на устойчивость к гипоксии, была разработана проф. Лукьяновой [Лукьянова и др., 1999; Лукьянова, Коробков, 1981]. В работе использовались самцы крыс линии Вистар массой 250-300 г., которых помещали в барокамеру. Группа высокоустойчивых (ВУ) – животные, которые выдерживали острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин. Группа низкоустойчивых (НУ) животных выдерживала эту высоту только в течение 1-1.5 мин.
Глава 5. Результаты и обсуждения
5.1 Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии
В этом разделе работы исследовались такие показатели, как дыхание МХ, скорость АТФ-зависимого К+ транспорта, количество К+ в МХ, а также чувствительность этого транспорта к АТФ у крыс с различной резистентностью к гипоксии.
5.1.1 Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии
Несмотря на то, что участие митоКАТФ в защите миокарда и других тканей от ишемических повреждений не вызывает сомнений, механизм позитивного действия активаторов этого канала остается неясным. Для изучения этого вопроса в работе исследовались параметры дыхания и окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к недостатку кислорода, а также у животных, адаптированных к гипоксии.
Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии показало, что скорость дыхания МХ во всех метаболических состояниях у высокоустойчивых животных значительно ниже таковой у низкоустойчивых (Рис.5). Следует отметить, что высокоустойчивые животные – это животные, которые выдерживали острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин. Группа низкоустойчивых (НУ) животных выдерживала эту высоту только в течение 1-1.5 мин.
Рисунок 5. Скорость дыхания МХ высоко- и низкоустойчивых к гипоксии
НУ – низкоустойчивые к гипоксии животные, ВУ – крысы, высокоустойчивые к гипоксии. Концентрация белка в кювете – 1-2 мг/мл. Среда инкубации: 5 мМ Tris-HCl, 200 мМ сахарозы, 50 мМ KCl, 5 мМ NaH2PO4, 3 мкМ ротенона, рН 7.2. Эксперименты проводились в закрытой ячейке при постоянном перемешивании и термостатировании при температуре 26°С.
При этом измерение дыхательного контроля времени фосфорилирования АДФ показало, что окислительное фосфорилирование, то есть синтез АТФ происходит более эффективно у высокорезистентных крыс (Рис.6).
Рисунок 6. Дыхательный контроль и время фосфорилирования МХ крыс с различной устойчивостью к гипоксии
ВУ – высокоустойчивые к гипоксии крысы, НУ – низкоустойчивые к гипоксии животные. Условия как на рис. 7.