2.2 Простейшие
Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. В настоящее время они привлекли внимание исследователей как продуценты биологически активных веществ.
В этом качестве рациональнее использовать свободноживущих простейших, обладающих разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе.
Особую экологическую нишу занимают простейшие, обитающие в рубце жвачных животных. Простейшие рубца могут быть источником фермента целлюлазы, способствующей разложению клетчатки в желудке жвачных. Возбудитель южноамериканского трипаносомоза — Trypanosoma (Schizotrypanum cruzi) стала первым продуцентом противоопухолевого препарата круцина (СССР) и его аналога—трипанозы (Франция) [3].
Применение к простейшим общепринятого в микробиологии приема повышения биосинтеза липидов за счет снижения содержания в среде источника азота и увеличения содержания источника углерода привело к резкому торможению или остановке роста культур. Российские ученые получили водорастворимый полусинтетический препарат — астазилид, представляющий собой комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, предварительно выделенных из А. longa. Препарат не обладал прямым цитотоксическим действием на культуру опухолевых клеток, а его противоопухолевое действие, изученное на 8 штаммах перевиваемых опухолей мышей и крыс, реализовалось через иммунную систему.
Другой группой биологически активных веществ простейших являются полисахариды.
Разнообразие полисахаридов, синтезируемых простейшими, достаточно велико. Особый интерес представляет парамилон, характерный для эвгленоидных жгутиконосцев. Представители родов Astasia и Euglena способны к сверхсинтезу парамилона, составляющему свыше 50 % сухого остатка клеток. Этот полисахарид изучается как стимулятор иммунной системы млекопитающих.
2.3 Водоросли
В целом ряде стран водоросли используют как весьма полезную витаминную добавку к кормам для сельскохозяйственных животных. Но гидролизаты белка зеленой водоросли Scenedesmus используются и в медицине и косметической промышленности. Таким образом, культивируя эту водоросль, можно получать глицерол, пигмент и белок, что весьма перспективно с экономической точки зрения [9].
Одним из самых ценных продуктов, получаемых из красных водорослей, является агар — полисахарид, присутствующий в их оболочках и состоящий из агарозы и агаропектина. Водоросли — единственный источник получения агара, агароидов, каррагинина, альгинатовВ нашей стране основным источником агара служит красная водоросль анфельция.
Бурые водоросли богаты также весьма полезным соединением — шестиатомным спиртом маннитом, который с успехом применяют в фармацевтической и пищевой промышленности.
3. Методы скрининга источников ЛС
На этапе планирования биологических испытаний синтезированных соединений разработчик выбирает между двумя принципиальными стратегиями тестирования. В рамках первой стратегии новые соединения испытываются на одной или нескольких выделенных белковых биомишенях, функционирование которых связано с определенными патологическими состояниями.
Важно, что результаты первичных испытаний на индивидуальной биомишени позволяют обнаруживать закономерности зависимости между структурными особенностями молекул и их активностью (зависимости «структура-свойство» или SAR, от англ. structure-activity relationships), что в свою очередь позволяет направленно отбирать соединения для последующих циклов тестирования. Было показано, что несколько раундов такого скрининга, усиливаемых SAR-зависимостями, являются чрезвычайно эффективным средством поиска высокоактивных молекул [6].
В последнее десятилетие, особенно в связи с появлением высокопроизводительных автоматизированных систем биологического скрининга, она стала базовой стратегией поиска активных соединений на ранних этапах разработки лекарств.
При всей своей привлекательности эта стратегия имеет ряд весьма существенных недостатков. Главным из них является то, что при переходе к испытаниям на более комплексных объектах (клетки, ткани или целые организмы) результаты испытаний часто оказываются неадекватными по той причине, что на активность лекарства в реальной физиологической ситуации влияет большое число факторов, которые упрощенная тест-система не способна воспроизвести.
Практика разработки лекарственных средств в последние годы свидетельствует о том, что безоглядная ставка на масштабный скрининг больших библиотек соединений не привела к реальному увеличению числа выведенных на рынок новых лекарств.
Сравнительные характеристики стратегий биологического скрининга
рис.1
| Стратегия скрининга | Особенности | Результат |
| in vitro скрининг – на выделенных биомишенях | – возможность тестирования больших библиотек соединений (десятки и сотни тысяч); – возможность обнаружения SAR-зависимостей и последующей оптимизации активных структур; – высокая скорость анализа | in vitro «хиты» с высокой активностью по отношению к отдельной биомишени, но неясными перспективами активности в реальных физиологических условиях |
| in vivo испытания – (модели животных) | – малая производительность; – длительность экспериментов (до нескольких месяцев); – проблематичность эффективной оптимизации на основе полученных результатов | cоединения с фармакологически значимой активностью, но с неизвестным механизмом действия |
| «обратный» скрининг – на панели биомишеней | – малая производительность по числу соединений; – высокая скорость анализа; – возможность оценки активности соединения по отношению к десяткам и даже сотням биомишеней | cоединения с охарактеризованным мишень-специфичным профилем и потенциальными новыми терапевтическими индикациями |
Альтернативная стратегия биологических испытаний - этота, при которой химические соединения тестируются с использованием модельных систем, более приближенных к живым организмам объектам терапевтического воздействия. Примерами могут служить культуры клеток или тканей, патогенные организмы (например, бактерии) и даже животные. Соединения, активные по отношению к таким объектам, являются гораздо более ценными кандидатами в лекарства, чем вещества, проявившие активность в пробирочных тестах на выделенных белках. Однако здесь тоже существуют препятствия:
- стоимость испытаний на животных во много раз превышает стоимость in vitro испытаний. Это приводит к невозможности испытаний больших библиотек соединений.
- на активность соединений в подобных экспериментах влияет множество факторов, таких как природа молекулярной биомишени, эффективность проникновения соединений через биологические мембраны, скорость метаболитической деградации соединений в тестируемых объектах и другие.
Поэтому на основании подобного тестирования сложно создать адекватные модели связи структуры с активностью, которые являются ценным подспорьем при оптимизации активных молекул. Пробирочные испытания на выделенных биомишенях также не позволяют адекватно судить о мишень-специфичной фармакологии лекарственного кандидата.
Известно, что в настоящее время лекарственные соединения в большинстве является по своей природе полифункциональными. То есть в реальных физиологических условиях они действуют на ряд биомишеней в организме человека. Следовательно, даже в случае успешного преодоления барьера «in vitro» исследователи не имеют полной ясности относительно механизмов функционирования [5].
Производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость.
Разработчики лекарственных средств оказываются в непростой ситуации: пробирочные испытания на выделенных биомишенях оказываются чрезмерно упрощенной моделью, а более приближенные к реальности эксперименты отличаются высокой стоимостью и малой производительностью. В обоих случаях полученные результаты слабо поддаются интерпретации с точки зрения механизма действия активных соединений.
Экспериментальным подходом, позволяющим эффективно дополнить описанные выше стратегии биологических испытаний и существенно повысить эффективность создания лекарственных средств, является «обратный» скрининг. В отличие от прямого биологического скрининга больших библиотек химических соединений на одной или нескольких биологических мишенях, в рамках концепции «обратного» скрининга одно или несколько соединений, обладающих доказанными фармакологическими эффектами, но неизвестными (или не до конца понятными) механизмами действия, тестируются на большой панели биомишеней, соответствующих типу фармакологической активности (см. рис.1).
В результате обнаруживаются биомишени для действия исследуемого вещества, что является ключевым шагом к оценке его мишень-специфичной фармакологии. Если тестируемое вещество является разрешенным лекарственным препаратом, уточнение профиля мишень-специфической активности может позволить найти новые потенциальные области его терапевтического применения. В этом случае возможно создание препарата причем со значительно меньшими затратами.