К методам лабораторной диагностики оспы натуральной относятся: микроскопическое исследование мазков из кожных поражений; серологические реакции для обнаружения оспенного антигена в крови больных или в кожных поражениях; выделение вируса на культурах ткани или хориоаллантоисных оболочках куриных яиц; заражение кроликов (феномен Пауля). Кроме того, методами серологических реакций определяются появление и нарастание в крови у больных оспой натуральной специфических противооспенных антител.
Взятие материала от больных. Кровь берется в количестве 5 млиз локтевой вены в стерилизованную пробирку с резиновой пробкой. Сыворотка, освобожденная 'от сгустков, может быть использована для выделения вируса, для обнаружения антигена и для серологических реакций. В некоторых случаях из сгустка готовится суспензия, также используемая для выделения вируса.
В макулопапулезной стадии болезни для выделения вируса применяется смыв из глотки больного, который производится тщательным прополаскиванием физиологическим раствором.
Из кожных поражений папулы, везикулы, пустулы, корки берется материал как для микроскопических исследований, так и для выделения вируса. Для этой цели поверхность оспины слегка смазывается спиртом и после высушивания производится соскоб или прокалывание тонкооттянутым капилляром пастеровской пипетки. Корки для исследования отделяются пинцетом. Полученный материал используется для выделения вируса и, кроме того, наносится на предметные стекла (не менее двух). Мазки или отпечатки высушиваются на воздухе и окрашиваются по Морозову, Гутштейну или Пашену.
Если взятый материал не может быть немедленно отправлен в лабораторию, он помещается в простерилизованные ампулы, которые тут же запаиваются. Все лабораторные работники, занятые взятием и обработкой материала от больных, должны быть ревакцинированы и строго соблюдать предосторожности, предохраняющие против заражения себя и окружающих.
Микроскопические исследования. Окраска по Гутштейну заключается в обработке мазков метилвио-летом и 2% раствором углекислого натрия в дистиллированной воде после фиксации в метиловом спирте в течение 30 мин. Для окраски по Пашену высушенные на воздухе мазкн фиксируют метиловым спиртом (10 мин.) и протравливают синькой Леффлера при нагревании до появления паров, промывают дистиллированной водой, окрашивают карболовым фуксином Циля 3 мин., нагревая до появления паров, и снова промывают дистиллированной водой. Затем препараты дифференцируют абсолютным спиртом или 5% раствором танина в течение 5 мин.
При исследовании в иммерсионной системе светового микроскопа частицы вируса оспы натуральной (тельца Пашена) выглядят в виде сферических телец, окрашенных по Морозову в темно-коричневый цвет, по Гутштейну — в светло-лиловый и по Пашену — в розово-красный.
Микроскопические исследования наиболее результативны в течение папуло-везикулярной фазы болезни и затруднительны во время пустулезной фазы, когда в препарате находятся не только тельца Пашена, но и разные артефакты. Обнаружение телец Пашена имеет несомненную диагностическую ценность, но не всегда позволяет дифференцировать оспу натуральную от генерализованной вакцины, коровьей оспы, ветрянки. Отсутствие телец Пашена при соответствующих клинических и эпидемиологических показателях не исключает вероятность диагноза оспы натуральной.
Серологические реакции, применяемые для обнаружения антигена, и приготовление иммуносыворотки. Для обнаружения специфического оспенного антигена может быть использована реакция связывания комплемента в обычной прописи с учетом следующих необходимых особенностей. В качестве антигена используется негемолизнрованная сыворотка, предварительно инактивированная при 1° 56° в течение 30 мин., или материал, взятый из кожных поражений. Корочки предварительно растираются в ступке и разводятся 1 : 10 физиологическим раствором.
Загрязненный материал рекомендуется обрабатывать эфиром с добавлением пенициллина и стрептомицина в течение 45 мин. В качестве иммунной сыворотки используется сыворотка кроликов, предварительно иммунизированных вирусом вакцины. Разные разведения антигена с коэффициентом 2 соединяются с другими ингредиентами реакции и инкубируются при 1° 4° в течение 12—16 час.
С той же целью может быть применена методика выявления оспенного антигена, основанная на принципе диффузии в агар, по Краул. По рекомендации С. С. Маренниковой реакция ставится следующим образом. К расплавленному 1% агару, приготовленному на фосфатно-солевом буфере рН=7,2, добавляют мертиолят в конечной концентрации 1 : 10 000 и наносят слои в 1 мм на предметное стекло. В остывшем агаре прорезают четыре круглых углубления 3 мм в диаметре на расстоянии 5—6 мм. Углубления маркируют соответственно назначению. Одно углубление предназначено для специфической иммунной сыворотки, другое — для контрольной, нормальной, сыворотки, третье — для испытуемого материала и четвертое — для известной культуры вируса вакцины. Предметное стекло с наполненными углублениями помещают во влажную камеру и оставляют на 4—24 часа при 1° 20°.
Реакция считается положительной в случае появления полосы преципитации между углублениями с испытуемым материалом и специфической иммуннойсывороткой при одновременном появлении аналогичной полосы преципитации между той же сывороткой и известным антигеном. При этом полосы преципитации не должно быть между антигенами и нормальной сывороткой. Реакция преципитации в агаре определяется через 4—5 часов после постановки.
Иммунную сыворотку, применяемую для данной реакции и в других сходных целях, приготовляют путем вакцинации кроликов. На несколько участков выбритой чистой поверхности кожи животных наносят путем скарификации или внутрикожных инъекций 1 мл дермовакцины. После заживления кожных поражений животным внутривенно вводят трижды с недельным интервалом дермовакцину, очищенную путем дробного центрифугирования от тканевых балластных компонентов. Через 2 недели после последней иммунизации у кроликов берут кровь, отделяют сыворотку, инактивируют 45 мин. при 1° 56°, разливают в ампулы и хранят в замороженном состоянии.
Выделение вируса. Выделение вируса оспы натуральной удается на всех этапах развития болезни и даже в процессе выздоровления. Материалом для исследования служат кровь и кожные поражения. Выделение вируса из крови дает положительный результат в первые два дня болезни, а в более поздние сроки свидетельствует о тяжелом течении оспы натуральной и указывает на неблагоприятный прогноз.
Выделение вируса производят из сыворотки крови и, учитывая возможность маскирования его антителами, из сгустка, который предварительно растирают в ступке с физиологическим раствором. Если можно дифференцировать форменные элементы, то предпочтение в этом случае отдают лейкоцитам.
Выделение вируса из кожных поражений производят путем разведения жидкости, полученной из оспин, или тщательно растертых в ступке соскобов и корочек (в соотношении 1 : 5) в 1,5 мл физиологического раствора, содержащего от 200 до 1000 ЕД пенициллина и 5 мг стрептомицина. По 0,2 мл вводят на хорио-аллантоисную оболочку не менее пяти развивающихся куриных эмбрионов и в пробирки с культурой ткани. Оставшуюся жидкость наносят на поверхность кровяного агара для выявления возможного наличия бактерий.
Для выделения вируса используют И— 12-дневные развивающиеся куриные эмбрионы, которым испытуемый материал вводят на хорио-аллантоисную оболочку со стороны воздушного мешка. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют при 1° 35—36° в течение 72—96 часов при обязательном ежедневном просмотре с отбором погибших зародышей. По истечении срока инкубации, равно как и при отборе погибших зародышей, яйца вскрывают, извлекают хорио-аллантоисную оболочку, осторожно расправляют и погружают в чашку Петри со стерильным физиологическим раствором. Дно чашки помещают на черный фон, позволяющий более отчетливо видеть пятна оспин, образующихся на поверхности оболочек. При положительном результате исследования на оболочке формируются белые, резко отграниченные точечные образования, похожие на узелки или бляшки, без зоны некроза и геморрагии.