Розділення періоду культивування на два окремі етапи і, відповідно, використання гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки в складі середовищ вирощування сприяє розвитку ембріонів до стадії бластоцисти. Найкраще розвиваються ембріони в середовищі RPMI-1640. За 10 діб культивування отримано 18,4% бластоцист і в тому числі 7,2% без прозорої оболонки. Менше бластоцист при культивуванні в середовищах Іґла та ТС 199, відповідно, 28 (14,9%) і 17 (11,0%). З них без прозорої оболонки, відповідно, 11 (5,8%) та 2 (1,3%).
Окисно-відновні процеси в бластоцистах корів. В процесі розвитку ембріони використовують кисень та проявляють відновну здатність. Існує пряма залежність стадій розвитку бластоцист з дихальною активністю (ранні бластоцисти 0,09±0,01 нг-атом О/ембріон/хв, на 10,0% вище у пізніх, максимальна у бластоцист без прозорої оболонки – 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон /хв) і обернена – з відновною (ранні – 37,0±9,00 пкг К3…/ембріон/хв, у пізніх нижча на 21,7% і у бластоцист без прозорої оболонки найнижча – 13,0±2,01 пкг К3…/ембріон/хв).
Вивченням особливостей використання кисню ембріонами виявлено, що гальмування гліколізу стимулює дихальну активність у ранніх бластоцист на 29,1%, пізніх на 40,2%, у бластоцист без прозорої оболонки – у два рази. При цьому, швидкість відновлення фериціаніду у перших та других зменшується, відповідно, на 69,1% та 56,6%, у третіх – підвищується на 20,7% (63,0±32,0 пкг К3.../ембріон /хв). Отже, у ранніх та пізніх бластоцист, відповідно, 69,1 та 56,6% і без прозорої оболонки – не більше 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються в позаклітинний простір.
При інгібуванні НАД-залежної ділянки дихальна активність бластоцист знижується: ранніх стадій, пізніх та без прозорої оболонки, відповідно, на 66,3, 43,8 та 65,7%. Відновна здатність також знижується у перших на 17,9%, других на 10,5%, а без прозорої оболонки – підвищується більше ніж у два рази (150,0±25,07 пкг К3.../ембріон/хв). Аналогічно, зі зміною стадії розвитку ембріонів до бластоцисти без прозорої оболонки знижується азидрезистентна компонента дихання з 67,7% до 29,1% та відновна активність на 38,7% і 28,4%.
Інгібітор вільнорадикального окиснення жирних кислот (NaEДTA) гальмує споживання кисню у бластоцист на ранній та пізній стадіях, відповідно, на 59,1% і 67,3%, без прозорої оболонки – на 37,5% (від спожитого кисню азидрезистентною компонентою дихання). Наведені дані свідчать, про наявність в ембріонів альтернативних оксидазних і оксигеназних процесів.
ВИСНОВКИ
У дисертації узагальнено роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченні фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг та регуляцію окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, ооцитів – у процесі дозрівання та після запліднення – росту ембріонів, виявлені чинники, які забезпечують оптимальне співвідношення процесів окиснення та відновлення у статевих клітинах, встановлені маркери інтенсивності вказаних процесів. На підставі результатів досліджень, розроблені практичні пропозиції з об’єктивного і вірогідного оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекції інтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo та ооцитів – in vitro.
1. Спермії свіжоотриманих еякулятів чорно-рябих бугаїв молочних порід характеризуються такими біохімічними та фізіологічними показниками: інтенсивність використання кисню 5,3–60,7 нг-атом О/108 сперміїв/хв, швидкість відновних процесів 0,1–26,0 мкг К3…/108сперміїв/хв, активність СДГ 0,5–55,0 мкМ/хв/л, ЦХО 0,5–100,0 мкМ/хв/л, вміст фракцій білків – альбуміну 5,5–38,9%, глобулінів: a- 15,1–69,1%, b- 4,0–32,1%, g- 12,2–54,0%, аскорбінової кислоти 5,0–110,0 мкг/мл, продуктів окиснення (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот) 0,5–45,0 мкг/мл та сумарний вміст 5–150,0 мкг/мл. Величини біохімічних і фізіологічних показників проявляють значну мінливість внаслідок індивідуальних особливостей плідників, черговості отримання еякулятів, сезону року, віку, походження бугаїв, інших факторів.
2. У спермі бугаїв існують позитивні кореляції сильні (h = 0,70–0,74) та середньої сили (h = 0,46–0,65) між інтенсивністю використання кисню, мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, активністю окисних ферментів. Неоднозначна сила взаємозв’язків між корелюючими біохімічними показниками свідчить про інтенсивність окисно-відновних процесів і визначає фізіологічні показники сперміїв. Сильна кореляція (h = 0,70–0,71) між активністю СДГ, ЦХО і фізіологічними показниками сперміїв дає підстави до використання обох ферментів для оцінювання якості та запліднювальної здатності сперміїв свіжоотриманих і розморожених еякулятів бугаїв.
3. У спермі бугаїв існує оптимум окисно-відновних процесів та показників, а саме, дихальна активність 17,3–20,9 нг-атом О/108сперміїв/хв, її компоненти: мітохондріальна 8,5–10,4 та азидрезистентна 9,9–12,7 нг-атом О/108сперміїв /хв, активність ЦХО 31,8–36,7 і СДГ 14,9–17,5 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти і продуктів окиснення 41–50 і менше 10 мкг/мл, альбуміну 15–20%, глобулінів: a- 30–50%, b- і g- менше, відповідно, 15 і 25%. Оптимум вказаних процесів і показників характерний для еякулятів за об’ємом 2,0–6,0 мл, концентрацією сперміїв 0,60–1,40Ч109 /мл і кількістю живих 60–80%, що забезпечують виживання сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (+46,5°C) 72,7–126,5 хв, розморожених (+38°С) 312,0–373,9 хв, резистентність, відповідно, 22,5–44,5 і 11,3–32,4 тис.
4. ”Окисне навантаження” в еякулятах бугаїв зменшує використання кисню сперміями та відновну активність, підвищує чутливість ланок дихального ланцюга до інгібіторів. Відновлена форма глутатіону нівелює вплив т-БГП на окисно-відновні процеси у сперміях, стимулює їх інтенсивність при окисненні ендо- та екзогенних субстратів, забезпечує захист від факторів зовнішнього середовища та зберігає метаболічну активність енергогенеруючих ланок. Аскорбінова кислота, стимулює транспорт електронів у дихальному ланцюзі і окисні процеси не пов’язані з синтезом АТФ. Аскорбінова кислота чи відновлена форма глутатіону, додані по 2,50 мМ або у поєднанні (аскорбінова кислота : відновлена форма глутатіону) 1,25+2,50 мМ до свіжоотриманої розбавленої сперми, забезпечують у процесі інкубування за температури + 46,5°С показники виживання сперміїв 77,1–94,3 хв та збереженості 33,2–48,7%. Аскорбінова кислота та відновлена форма глутатіону 0,35:2,5 мМ додані до розріджувача сперми, підвищують запліднювальну здатність сперміїв.
5. Інкубування сперміїв, отриманих із придатка сім'яника, у середовищі з гомогенатом слизової матки корови, фолікулярною рідиною, гепарином забезпечує максимальну кількість їх з морфологічними та біохімічними показниками, характерними для акросомної реакції та капацитації: втрачається розділення між акросомою та головкою, інтенсивно поглинають кисень та зростають інтенсивність мітохондріального та немітохондріального дихання, відновна здатність, підвищується активність Г-6-ФДГ, СДГ (активних сперміїв). Значні коливання величин досліджуваних показників у зв’язку з факторами капацитації свідчать про відмінності сперміїв до дозрівання in vitrо і різну запліднювальну здатність.
6. У процесі інкубування сперми та капацитації сперміїв знижується вміст альбуміну на 2,6–23,7% і a-глобулінів на 5,9%, підвищується – g-глобулінових фракцій на 0,5–15,3%. Зміни білкового спектру свіжоотриманої інкубованої сперми залежать від величин показників якості еякулятів і активності СДГ. Для капацитованих сперміїв характерне зростаннявмісту білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa та зменшення – 20,1 і 94,0 кДa. У збережених пробах (сперміях і супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується – від 45,0 до 67,0 кДa.
7. Висока ооцитпродуктивність характерна для яєчників “раннього” та “пізнього” жовтого тіла (3,0–3,4 ОКК з одного яєчника) і менша (2,4 ОКК) – “фолікулярного зростання” та “свіжої овуляції”. Існує сильна позитивна кореляція (h = 0,81) між кількістю вилучених ооцитів і розміром фолікулів менше 4мм.
8. У фолікулярній рідині яєчників корів вміст загального білка становить 6,4–7,8 г%, альбумінів 33,6–44,5%, глобулінів (%): б- 9,5–14,1, в- 13,8–18,5, г- 30,0–42,3, глікопротеїнів у складі фракцій: альбуміну 5,4–33,1% і глобулінів: б- 12,7–28,4, в- 13,9–21,7, г- 27,3–60,4. Величини наведених показників у фолікулярній рідині залежать від розміру фолікулів (h = 0,10–0,72) та фізіологічного стану яєчників корів (h = 0,11–0,66). Яєчник зі “свіжою” овуляцією характеризується високим вмістом g- глобулінів 32,4–42,3% і глікопротеїнів 56,6–68,9%.
9. Активність клітин гранульози становить: дихальна – 8,1–25,1 нг-атом О/0,1мл СК/хв, відновна – 0,4–2,3 мкг К3.../мл СК/хв. Значення показників залежать від розміру фолікулів і становлять: дихальна – малий фолікул 8,1–18,1; середній – 8,2–17,0; великий – 8,7–13,5 нг-атом О/0,1мл СК/хв і відновна, відповідно, 0,7–2,3; 0,6–1,9; 0,4–0,7 мкг К3.../мл СК/хв. Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози залежить від фізіологічного стану яєчників корів. Енергетичні потреби клітин гранульози, в залежності від розміру фолікулів та фізіологічного стану яєчників корів, забезпечуютьсягліколізом на 9,9–42,3% і диханням – 27,2–47,6%.Із загальної кількості використаного кисню 26,5–55,5% припадає на ціанід-(азид-) резистентне дихання.
10.Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози характеризує розвиток та дозрівання ооцитів у яєчниках корів:“очікування“– низькі величини дихання (8,1–8,8 нг-атом О/0,1мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти (0,2–0,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв) і відновної здатності (0,6–0,8 мкг К3.../мл СК/хв) у яєчнику “свіжої овуляції”; “дестабілізації” – зростання дихання (до 13,5–25,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв) та ціанідрезистентної компоненти (до 1,0–3,4 нг-атом О/0,1мл СК /хв), відновної здатності (до 0,7–2,3 мкг К3.../мл СК/хв) – “раннє” жовте тіло; “стабілізації” – збереження високих значень споживання кисню (12,2–18,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв), зниження відновної здатності (0,7–0,9 мкг К3.../мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти дихання (0,1–0,4 нг-атом О/0,1мл СК/хв) – “пізнє” жовте тіло; “гальмування” – зниження дихання (8,8–15,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв), ціанідрезистентної компоненти (0,2–2,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв), відновної здатності (0,4–1,2 мкг К3.../мл СК/хв), зростання NаЕДТА-чутливої компоненти дихання (1,0–1,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв) – “фолікулярне зростання”. На ранніх етапах розвитку фолікула клітини гранульози виявляють більший вплив на ооцит у зв’язку зі значним використанням субстратів для росту. З нагромадженням поживних речовин відбувається зворотна реакція, що зумовлює інгібуючий вплив ооцита на інші клітини.