Отримані результати підтверджують той факт, що ендотеліальні клітини володіють сильною системою захисту від ушкоджувального впливу агресивних факторів, що і проявилося значним збільшенням потенціалу NOS (Р<0,001). Стосовно активності аргінази, то в умовах сумісної інкубації клітин, в ендотеліоцитах виявлено зменшення її активності у 2,5 раза (Р<0,05). Одночасно відзначено падіння рівня сечовини в клітинах ендотелію, проте воно було недостовірним.
Аналіз кооперативної взаємодії лімфоцитів та клітин ендотелію у тварин із змодельованою хронічною гіперімунокомплексемією виявив дещо інші особливості у процесах метаболізму оксиду азоту. Так, інкубація лімфоцитів в присутності ендотеліоцитів по відношенні до контролю показала істотне підвищення в 3,6 раза іNOS (Р<0,001) та зменшення в 2,2 раза сNOS (Р<0,001). Досить цікавим за цих умов є зниження вмісту NO2Ї- аніону у порівнянні з клітинами контролю (Р<0,001), показник рівня NO3Ї – аніону є також понижений (Р<0,001). Паралельно у досліджуваних тест-об’єктах зменшується і вміст GSNO (Р<0,001). Показник сумарної активності NOS за цих умов також вірогідно знижений (Р<0,05). Активність аргінази у цих клітинах зростає в 1,5 раза (Р<0,05), а вміст сечовини в 5,6 раза (Р<0,05). Інкубація ендотеліоцитів з лімфоцитами дослідних тварин показала зростання іNOS (Р<0,05) по відношенні до контролю, активність NOS, сNOS, рівень стабільних метаболітів та вміст GSNO за даних умов є пониженим. Зміни, виявлені за цих умов у показниках аргінази і сечовини, є наступними: підвищена аргіназна активність (Р<0,05) та значно (на 53%) зростає вміст сечовини (Р<0,05), що в даній ситуації може бути свідченням розвитку оксидантного стресу в ендотеліальних клітинах.
Отже, отримані результати дозволяють припустити, що при хронічному гіперімунокомплексному процесі пониження синтезу оксиду азоту в активованих лімфоцитах прямо або опосередковано призводить до зміни в процесах його синтезу у ендотеліальних клітинах, що в подальшому може призвести до порушення функціональної здатності ендотелію та ушкодження судин. Гальмування фізіологічної регуляторної функції оксиду азоту при хронічній гіперімунокомплексемії створює умови для інгібування NO-синтазного шляху і веде до активації аргіназного шляху метаболізму L-аргініну.
Для з’ясування особливостей дії корвітину на два шляхи метаболізму NO в умовах in vitro дослідження проведено, як у контрольній групі тварин, так і у тварин із змодельованим хронічним гіперімунокомплексним процесом.
Присутність корвітину в інкубаційному середовищі інкубованих лімфоцитів та ендотеліоцитів інтактних тварин призвела до пониження у лімфоцитах рівня іNOS (Р<0,05), NO2Ї(Р<0,05) та вмісту GSNO (Р<0,05). За даних умов прослідковується тенденція до зростання показників: NOS (Р<0,05), сNOS (Р<0,05) та NO3Ї (Р<0,05). Присутність корвітину інгібувала активність аргінази у лімфоцитах в 2,4 раза (Р<0,05), вміст сечовини за цих умов не змінився. Аналогічні дослідження, проведені в ендотеліоцитах інтактних тварин, не виявили вірогідних змін у показниках метаболізму L-аргініну.
Додавання корвітину до інкубаційної суміші клітин за умов хронічної гіперімунокомплексемії виявило його коригуючий вплив на процеси синтезу оксиду азоту.
Так, наявність корвітину призвела до зниження активності іNOS (Р<0,05), активація якої спостерігалась за умов інкубації лімфоцитів з ендотеліоцитами при хронічній гіперімунокомплексемії. Паралельно підвищився вміст сNOS та рівень стабільних метаболітів у лімфоцитах (Р<0,05), інгібована активність аргінази (Р<0,05) та вміст сечовини (Р<0,05). Виявлено також виражений нормалізуючий ефект корвітину на функціональну активність ендотеліоцитів, що проявилося зниженням активності індуцибельної NO-синтази (Р<0,05), пониженням рівнів NO2Ї (Р<0,05)і NO3Ї (Р<0,05)та вмісту GSNO (Р<0,05). Активність аргінази за даних умов понизилась у 2 рази (Р<0,05), що навіть перевищує показник контролю в 1,6 раза (Р<0,05), вміст сечовини також зменшився у 3,4 раза (Р<0,05).
Отже, отримані експериментальні дані свідчать, що в умовах in vitro протекторні особливості водорозчинної форми корвітину пов’язані, перш за все, із його здатністю специфічно пригнічувати активність індуцибельної NO-синтази, без інгібування активності її конститутивної ізоформи в лімфоцитах і, особливо, в ендотеліальних клітинах за умов хронічної гіперімунокомплексної патології. Ця селективна властивість корвітину, за умов даного захворювання, проявляється також інгібуванням аргіназної активності і позитивною зміною неокисного шляху метаболізму L-аргініну на окисний.
Результати, отримані в умовах in vitro, стали основою для подальшого дослідження in vivo.
Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії в цих умовах супроводжується значними змінами імунологічних показників. У всіх дослідних тварин встановлено вірогідне зростання рівня ЦІК (Р<0,01) різної молекулярної маси. Високий рівень ЦІК можна пояснити виснаженням захоплювальної здатності фагоцитів впродовж 12 тижнів досліду. Підтримання хронічної персистенції ЦІК у судинному руслі може також бути результатом недостатньої активності рецепторів мембран еритроцитів, які є основними їх носіями до “кліренсних” органів (Stokol T. et al., 2004). За участю цього механізму вони елімінуються фагоцитарною системою (Дрюк Н.Н., 2002; Якобісяк М., 2004). При надмірному утворенні ЦІК ця система може не спрацьовувати, і вони починають проявляти патогенну дію по відношенню до клітин-мішеней. Підтвердженням порушення функцій мембран цих клітин свідчать роботи (Чоп’як В.В., 1998; Соловьев А.И., 2003; Jancar S., 2005). Крім того, це комплексоутворення є комплементзалежним (Р<0,05), оскільки в умовах довготривалої імунної відповіді склад імунних комплексів поповнюється новими антитілами, що створює умови для їх фіксації та активації системи комплементу. Активація системи комплементу також корелює із гіперпродукцією оксиду азоту, наслідком чого, можливо, є збільшення на поверхні ендотеліоцитів генів, які кодують хемокіни – ІЛ-8, МСР-1, RANTES (Sen C.K., 1996; Чоп’як В.В., 2004).
Зменшення показника гемолітичної активності сироватки крові при хронічній гіперімунокомплексемії може свідчити про посилене використання компонентів системи комплементу для зв’язування ЦІК з клітинами. За цих умов особливо страждає кілінгова функція фагоцитів, сприяючи накопиченню ЦІК на клітинах-мішенях, а також їх преципітації в судинному мікроциркуляторному руслі (Malinski T., 2004).
Перед тим, як застосувати корвітин для корекції порушень імунологічних показників у тварин із хронічним гіперімунокомплексним процесом, ми поставили за мету дослідити його вплив на інтактний організм. Таке дослідження дозволяє виявити вплив препарату на імунологічну та неспецифічну реактивність організму, чутливість окремих ланок імунної системи до його дії, а також виключити можливий дисрегуляторний ефект на механізм імунної відповіді.
Як свідчать результати проведених досліджень, показники ЦІК у сироватці крові інтактних тварин після введення корвітину достовірно знижуються (Р<0,001). За цих умов рівні ЦІК – великих, середніх та малих розмірів – зменшуються. Вивчення впливу корвітину на імунологічні показники інтактних тварин виявило, що даний препарат знижує рівні ЦІК усіх розмірів та показник гемолітичної активності сироватки крові, що може свідчити про підвищення елімінації ЦІК з кровоплину фагоцитуючими клітинами.
Результат оцінки впливу препарату на визначення вмісту ЦІК у сироватці крові щурів за умов імунокомплексної патології показав пониження рівня великих (Р<0,05), середніх (Р<0,05) і малих (Р<0,05) ЦІК та нормалізацію активності системи комплементу (Р<0,05), що свідчить про посилення механізмів фагоцитозу.
Відомо, що імунокомплексне ураження тканин прямо чи опосередковано пов’язано із змінами в метаболізмі оксиду азоту (Uesugi M., 1998). Отримані експериментальні дані показали, що розвиток хронічної гіперімунокомплексемії супроводжується експресією індуцибельної NO-синтази, активність якої в лімфоцитах зросла у 4,7 раза (Р<0,001), а в клітинах ендотелію у 2 рази (Р<0,01). Потенціал конститутивної NO-синтази за цих умов зазнає інгібування – на 61,6% (Р<0,001) в лімфоцитах (рис.1) та на 36,9% (Р<0,05) у ендотеліоцитах (рис.2).
Зміна показників ферментативної активності NOS супроводжуються підвищенням метаболізму аргіназного шляху NO: активність аргінази в лімфоцитах (рис.1) зросла у 5,1 раза (Р<0,001), вміст сечовини – 3,9 раза (Р<0,001); в ендотеліоцитах (рис.2) зміни в синтезі оксиду азоту є менш значними – активність аргінази зросла в 1,6 раза (Р<0,001), вміст сечовини – 1,9 раза (Р<0,001). Можливо, підвищення рівня сечовини у клітинах, при зміні утилізації аргініну на неокисний шлях метаболізму, має компенсаторне значення, враховуючи її відому антиоксидантну роль (Коцюруба А.В., 2000; Aoyagi K., 2003).
Інгібування ферментативної активності NOS може бути зумовлено пониженням біодоступності запасів L-аргініну (Зенков Н.К., 2000; Корж А.Н., 2003), що в подальшому може призвести до порушення рівноваги між двома шляхами – окисним (NO-синтазним) і неокисним (аргіназним). Окрім цього, виявлені зміни в активності NO-синтаз, очевидно, можуть бути пов’язані із тим, що активовані імунними комплексами фагоцити індукують продукування прозапальних цитокінів, які є промоторами iNOS в імунокомпетентних клітинах (Li H., Forstermann U., 2000; Nishimura M., 2004; Nangaku M., 2005). Стійка активація прозапальних цитокінів може створювати сприятливі умови для розвитку автоімуноагресії та подальшого підтримання гіперімунокомплексемії (Чоп’як В.В. 1998; Setiady Y., 2004; Norman M., 2005).