Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто поставлена мета роботи, сформульовані основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних. Автором проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: VI конференції молодих онкологів України (Київ, 2003); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); ІІІ з’їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004); 18 European association for cancer research (Інсбрук, Австрія, 2004); International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, (Київ, 2006); International Medical Students’ Congress in Novi Sad (Сербія, 2006); 17 European Student’s Conference (Берлін, Німеччина, 2006); IV з’їзді онкологів та радіологів СНД (Баку, Азербайджанська Республіка, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів та конференцій. Отримано 1 патент на винахід в Україні.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6-ти розділів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 11 таблицями та 36 рисунками. Список цитованої літератури налічує 215 першоджерел, у тому числі 195 зарубіжних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використано 478 мишей-самців лінії С57Bl/6 та 140 щурів-самців лінії Вістар, які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.
Штами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс були отримані з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплення експериментальних пухлин здійснювали загальноприйнятим методом. Вироблення резистентності пухлин до цисплатину досягали шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які одержували від тварин, котрим було проведено курс ін’єкцій цитостатику.
Після перещеплення суспензії пухлинних клітин тварини були поділені на дві групи: контрольну і дослідну. Цисплатин (“Ebewe”, Австрія) вводили тваринам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день – всього п’ять ін’єкцій. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильнийфізіологічний розчин. Пухлини дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали тваринам другого пасажу. В експериментах з карциномою Герена було проведено 12 послідовних перещеплень, в експериментах з карциномою легені Льюїс – 27. Вивчення кінетики росту пухлин та визначення показників системи протеолізу проводили у тварин контрольних груп.
Дослідження на щурах з кариномою Герена були проведені на 2 групах тварин: 1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному Герена (Guerin carcinoma, (GC));
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному Герена, попередньо проведену через 12 пасажів на щурах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (GC/R).
В серії досліджень на мишах з кариномою легені Льюїс використовували 4 групи тварин:
1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному легені Льюїс (Lewis lung carcinoma, LLC).
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 9 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC- 9).
3 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 19 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-19).
4 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 27 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-27).
Таким чином, в експериментах з карциномою легені Льюїс були використані пухлинні підштами, отримані на різних етапах формування резистентності: LLC-9 (початковий етап), LLC-19 (проміжний етап), LLC-27 (кінцевий етап). В експериментах з карциномою Герена був використаний пухлинний підштам, отриманий на кінцевому етапі формування резистентності до цисплатину (GC/R).
Аналіз кінетики пухлинного росту проводили для кожної тварини за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин (Weibull W, Sweden S., 1951). Кінетичні параметри росту пухлини визначали для кожної тварини контрольної групи за кінетичними кривими росту, які розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми “Microcal Origin 7.0”.
Параметр “а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту. Параметр “tlag” – латентний період росту первинної пухлини. Для аналізу динаміки змін кількості метастазів карциноми легені Льюїс використовували параметр “в” – швидкість метастазування, який характеризує темпи утворення метастатичних вузлів.
Визначення показників системи протеолізу проводили в плазмі крові тварин та пухлинній тканині. Для отримання плазми крові в якості антикоагулянта був використаний 3,8% розчин цитрату натрію в пропорції 9:1. Гомогенат пухлини готували на 0,05М трис-НСl буфері (рН 7,4).
ПРА плазми крові (мкмоль арг/хв на л плазми) чи тканини пухлини (мкмоль арг/хв на г білка) визначали за розщепленням аргінінвмісного лужного білка протамінсульфату спектрофотометричним методом К.М. Веремеєнка (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Принцип методу ґрунтується на визначенні пептидів, що містять аргінін, які відщеплюються від протамінсульфату протеолітичними ферментами пухлинної тканини чи плазми крові, що дозволяє визначати сумарну активність нейтральних серинових протеїназ. Вміст б1-ІП у плазмі крові (г/л) та тканині пухлини (мкг/мг тканини) визначали за здатністю останнього пригнічувати гідроліз трипсином синтетичного субстрата N- бензоїл -DL-аргінін-p-нітроаніліда (БАПНА).
Вміст б2М в плазмі крові (г/л) визначали за здатністю інгібітора утворювати з трипсином активний комплекс, який розщеплює синтетичний субстрат БАПНА, але є нечутливим до інгібітора з бобів сої (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за методом Lowry O.H. та співавт. (1951).
Усі отримані кількісні результати досліджень підлягали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням пакету прикладних програм “Microsoft Excel 7.0”. Із сукупності даних розраховували середнє арифметичне варіаційного ряду (М), похибку середнього арифметичного (m), критерій Ст’юдента (t), рівень значущості (р). Різницю вважали статистично достовірною при рівні значимості р<0,05. Ступінь кореляційного зв’язку між окремими показниками визначали з використанням комп’ютерної програми “STATISTICA 6.0” методом непараметричної рангової кореляції Спірмена (rho).
РЕЗУЛЬТАТИДОСЛІДЖЕНЬТАЇХОБГОВОРЕННЯ
На першому етапі дослідження доцільно було переконатися, чи дійсно отримані шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин підштами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс є резистентними до цисплатину. Дослідження показали, що у мишей із карциномою легені Льюїс по мірі зростання курсів введення цисплатину відмічали поступове зменшення впливу цитостатика на ріст первинної пухлини та її метастазування (табл. 1).
Таблиця 1
Протипухлинний та антиметастатичний ефект цисплатину при рості карциноми легені Льюїс (28 доба після перещеплення пухлини)
| Групи тварин | Діаметр первинної пухлини (мм)(n=10) | Гальмування росту первинної пухлини (%) | Середня кількість метастазів на тварину(n=10) | Зменшення кількості легеневих метастазів (%) | |
| LLC | контроль | 14,0 ± 0,3 | - | 24,2 ± 2,1 | - |
| цисплатин | 7,6 ± 0,5# | 46 | 8,6 ± 0,9# | 64,5 | |
| LLC-9 | контроль | 14,5 ± 0,6 | - | 20,2 ± 1,4 | - |
| цисплатин | 10,7 ± 0,6*, # | 26 | 10,8 ± 0,6# | 46 | |
| LLC-19 | контроль | 13,5 ± 0,5 | - | 27,6 ± 2,7 | - |
| цисплатин | 11,5 ± 0,8* | 15 | 20,4 ± 1,3# | 26 | |
| LLC-27 | контроль | 13,9 ± 0,5 | - | 29,8 ± 1,4* | - |
| цисплатин | 13,5 ± 0,6* | 3 | 26,4 ± 2,2 | 11 | |
Примітки:
* – P<0,05 у порівнянні з вихідною пухлиною;
# – P<0,05 у порівнянні з відповідним контролем.
Карцинома Герена після 12 послідовних курсів введення цисплатину також практично втратила чутливість до цитостатика: відсоток гальмування росту пухлини складав 4,2% (р>0,05), тоді як аналогічний показник в групі тварин з вихідною пухлиною досягав 95% (р<0,01).
Кінетика росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Зниження чутливості пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики їх росту. Зокрема, для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерною є пролонгація латентного періоду росту пухлини в 3,3 рази та підвищення швидкості її росту в 2,0 рази в експоненційній фазі порівняно з вихідною пухлиною (р<0,05).
Кінетика росту резистентних до цисплатину підштамів карциноми легені Льюїс також мала суттєві відмінності порівняно з такою у вихідній пухлині (рис.1).