КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКО
АБДУЛЛАЄВА МАЙЯ ВОЛОДИМИРІВНА
УДК: 578.825.12:578.74[058.86+078.33]:615.281
ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИВІРУСНОЇ АКТИВНОСТІ 6-АЗАЦИТИДИНУ ТА АМІЗОНУ В МОДЕЛЬНІЙ СИСТЕМІ: ЦИТОМЕГАЛОВІРУС – КУЛЬТУРА КЛІТИН ФІБРОБЛАСТІВ ЛЕГЕНЬ ЕМБРІОНА ЛЮДИНИ
03.00.06 – вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН та АМН України, РАМН, заслужений діяч науки і техніки України Фролов Аркадій Федорович
Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу загальної вірусології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна Інститут урології АМН України, завідувач лабораторії мікробіології, вірусології та мікології кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Нестерова Надія Віталівна Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії репродукції вірусів
Захист дисертації відбудеться “4” березня 2008 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, аудиторія 434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченко за адресою: Україна, 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 28” січня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізовано вченої ради О.В. Молчанець
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Цитомегаловірусна інфекція (ЦМВІ) на сьогодні особливо актуальна проблема сучасності. За оцінюючими даними, рівень інфікування цитомегаловірусом, як у cвіті так і у нашій країні становить більше 90% ( Trincado D.E., 2000; Нисевич Л.Л., 2002 та інш.).
Особливо важливе місце ЦМВІ належить у патології плоду, новонароджених і дітей раннього віку. Вона є однією із причин самовільних викиднів, передранніх пологів, вроджених вад розвитку, фетопатій. Небезпечною ЦМВІ є і для реципієнтів органів та кісткового мозку, онкологічних хворих та ВІЛ-інфікованих (Чешик С.Г., 2001).
Широкий спектр клінічних проявів та розповсюдженість ЦМВ серед усіх верств населення, спонукає звернути увагу на своєчасну діагностику ЦМВІ, враховуючи яку, можливо у найкоротший термін скоректувати стратегію лікування для хворих. Найбільш розповсюджені методи виявлення ЦМВ імуноферментний та полімеразної ланцюгової реакції мають ряд недоліків, із яких найбільш значний полягає у складності диференційної діагностики первинної, персистентної чи реактивованої інфекції. Це обгрунтовує використання у світовій лабораторній практиці нових методів ранньої специфічної експрес діагностики ЦМВІ.
Хіміотерапія ЦМВІ є складним і в багатьох випадках не вирішеним завданням. Існуючі хіміотерапевтичні засоби поки не дозволяють досягти повної зупинки продуктивної реплікації ЦМВ. Основні препарати, які специфічно інгібують репродукцію ЦМВ (ганцикловір, валганцикловір, фоскарнет і цидофовір) мають побічні токсичні ефекти (Дзюблик И.В, 1999; DeSmet M.D., 1999). А тривале застосування ганцикловіру у великих дозах викликає формування резистентності до ЦМВ (Mendez J.C, 1999). Крім того, довготривалі курси лікування до цього часу залишаються надзвичайно дорогими при сумнівному ефекті.
Саме тому актуальним питанням дослідження ефективності методів лабораторної діагностики ЦМВІ, які дозволяють встановити форму інфекції та пошуку нових анти-ЦМВ засобів із вивченням механізмів їх дії і було присвячено дану дисертаційну роботу. Даний напрямок досліджень дасть можливість вдосконалити методи діагностики та лікування ЦМВІ.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.Роботу виконано у відповідності з напрямом наукових досліджень Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, лабораторії загальної вірусології, у рамках тематичного плану “Вивчення механізмів епідемічного процесу при грипі та цитомегаловірусній інфекції”, завдань: “Цитогенетичні дослідження гострої та персистентної форми ЦМВ-інфекції”, та “Вивчення механізмів дії амізону та 6-аzaC на репродукцію ЦМВ in vitro” у 2001-2004 роках (шифр: 084, номер держреєстрації 01.02.U 000631).
Мета і задачі дослідження. Мета роботи — дослідження діагностичної цінності методів ранньої лабораторної діагностики ЦМВІ, а також вивчення анти-цитомегаловірусної активності 6-аzaC та амізону.
Для досягнення поставленої в роботі мети передбачалось вирішення наступних задач:
1. Встановити ефективність виявлення ранніх білків ЦМВ швидким культуральним методом та у тесті на виявлення антигенемії;
2. Дослідити можливість диференціації персистентної та гострої форм ЦМВІ за допомогою експресних методів лабораторної діагностики (ШКМ, ІФА, ПЛР, тАГ);
3. Вивчити цитотоксичну дію 6-azaC та амізону в культурі клітин фібробластів легень ембріона людини;
4. Дослідити анти-ЦМВ активність 6-azaC та амізону у дослідах in vitro;
5. Визначити вплив 6-azaC та амізону на синтез ранніх (р72, рр65) та пізніх (gB) вірусних білків в інфікованих клітинах.
Об’єкти дослідження – цитомегаловірус людини АD 169, лейкоцити та сироватки периферичної крові пацієнтів, антивірусні препарати, інфіковані та неінфіковані ЦМВ клітини культури ФЛЕЛ, моноклональні антитіла направлені до р 72, рр 65, gB білків ЦМВ.
Предмет дослідження – імунні комплекси антиген-антитіло, репродукція ЦМВ, цитотоксичність та анти-ЦМВ активність 6-azaC та амізону.
Методи дослідження – для виконання поставлених завдань використовували вірусологічні, молекулярно-біологічні та імунологічні методи, а також методи статистичної обробки результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Показано високу діагностичну цінність швидкого культурального методу, який підтверджує у 65% новонароджених і дітей раннього віку і у 70% хворих після трансплантації нирки - гостру форму ЦМВІ. Показано, що за допомогою тесту на виявлення антигенемії за 3-4 год. можливо виявити ранні білки вірусу і встановити форму перебігу ЦМВІ. Вперше встановлено анти-ЦМВ активність 6-аzaC та амізону in vitro, що дає змогу розглядати їх, як перспективні проти-ЦМВ агенти. Доведено, що механізм дії цих засобів полягає в інгібіції ситезу пізнього структурного білку gB.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані експериментально доводять високу ефективність застосування швидкого культурального методу та тесту на виявлення антигенемії, що дозволяє віддиференціювати гостру і персистентну форми ЦМВІ. За результатами досліджень було створено проект: “Модифікація і застосування швидкого культурального методу, як нової технології діагностики цитомегаловірусної інфекції” за №76/4 від 29.10.04 р. у напрямі: “Діагностика і методи лікування найпоширеніших захворювань”. Результати можуть бути використані в розробці методичних рекомендацій по діагностиці ЦМВІ у новонароджених та дітей раннього віку, а також у хворих після трансплантації органів чи тканин. Виявлена і підтверджена в дослідах анти-ЦМВ активність 6-azaC і амізону обґрунтовує необхідність наступних етапів оцінки препаратів, які можуть бути використані для клінічного впровадження, як нові проти-ЦМВ засоби. Результати даних досліджень відображені в деклараційних патентах: на винахід - №69986 А “Інгібітор цитомегаловірусу людини 2-b-D- рибофуранозил –5- аміно-1,2,4 – триазин –3 (2Н)- ОН”, на корисну модель - №10889 “Застосування 4-(N-бензил)амінокарбонілу –1-метилпіридинію йодиду як профілактичного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини”.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована наукова література по темі дисертації. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконана пошукачем особисто. Здобувачем самостійно проаналізовано одержаний експериментальний матеріал, який викладений автором у ряді статей у фахових виданнях та тезах доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях. Планування основних напрямків досліджень дисертаційної роботи, обговорення отриманих результатів та їх узагальнення здійснені під керівництвом д.мед.н, професора, чл.-кор. НАН та АМН України, РАМН, заслуженого діяча науки і техніки України Фролова Аркадія Федоровича.
При проведенні даних досліджень автор використовувала моноклональні антитіла до білків ЦМВ, які були отримані раніше у відділі клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, с.н.с., к.б.н. Макаровою Н.Е..
Значну частину досліджень виконано на базі лабораторії клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, Москва (д.б.н., проф. Кущ А.А., к.б.н. Федорова Н.Е.), лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (д.мед.н. Рибалко С.Л., к.б.н. Дядюн С.Т.). Автор засвідчує глибоку повагу та щиру вдячність за співпрацю, корисні поради та сприяння у виконанні роботи.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідались і апробовані на семінарах відділу загальної вірусології Інституту епідеміології та інфекційних хвороб АМН України та відділу клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, ХI Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, Росія, 2004); Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); IV Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, 2004); XIV з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Полтава, 2005).