Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини (стр. 3 из 5)
1. 1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;
2. *О/О – оптичні одиниці
Підсумовуючи отримані дані можна заключити, що метод ІФА для визначення анти-ЦМВ АТ не є надійним методом для діагностики ЦМВІ у немовлят і дітей раннього віку; швидкий культуральний метод у 65% немовлят та дітей раннього віку виявляє ранні білки ЦМВ, що підтверджує гостру форму ЦМВІ.
Детекція раннього білку рр 65 ЦМВ у тесті на виявлення антигенемії. Наступним етапом нашої роботи було адаптувати та застосувати експрес-тест на виявлення антигенемії у клітинах крові людини та порівняти ефективність даного методу з ШКМ та методом ПЛР.
Проведена нами адаптація даного тесту, на відміну від відомого “Clonab CMV HCMV pp 65-Antigen” фірми Biotest (Німеччина), ґрунтувалась на виявленні раннього антигену у лейкоцитах крові людини за допомогою оригінальних моноклональних антитіл та спрямована на спрощення, прискорення і здешевлення даної методики. У результаті проведених досліджень, нами було запропоновано:
- застосовувати предметні скельця з полілізиновим покриттям (найбільш ефективні для отримання препаратів розпластаних клітин);
- використовувати оптимальну концентрацію лейкоцитів 2х105 на препарат при об’ємі суспензії 0,20 – 0,25 мл;
- ефективним режимом для цитоцентрифугування є – 1500 об/хв, 7 хв;
- оптимальна концентрація оригінальних очищених моноклональних антитіл, для ефективного та специфічного застосування повинна складати - 1: 100.
У результаті запропонованих змін в тесті зберігалась більша кількість морфологічно цілих лейкоцитів, а комплекс АГ-АТ, що виявлявся за допомогою методу пероксидазного зафарбування, мав чіткий колір та контури.
Для дослідження діагностичної ефективності тесту на виявлення антигенемії ми відібрали групу хворих, що складалась із 17 пацієнтів після трансплантації нирки. Лiмфоцитарні фракції та сироватки хворих досліджували на наявність вірусних антигенів трьома методами: за допомогою тесту на виявлення антигенемії, швидкого культурального методу та полімеразної ланцюгової реакції (табл. 3). Досліди проводились у трьох повторах.
При порівнянні отриманих результатів встановлено, що методом ПЛР (якісний) у всіх 17-ти пацієнтів (100%) було виявлено ДНК ЦМВ (рис. 2). Дослідження лейкоцитів цієї групи хворих швидким культуральним методом виявило, що у 12 хворих (70%) було виявлено антиген ЦМВ, за допомогою тесту на виявлення антигенемії у лiмфоцитах крові, наявність раннього білку рр65 до ЦМВ було показано у 5-ти хворих (30%), при чому ці хворі мали клінічно виражені симптоми ЦМВІ і знаходились на гемодіалізі. Ідентичність результатів, отриманих ШКМ та у тесті на виявлення антигенемії спостерігалась у 10 хворих (59%) із них 5 позитивних та 5 негативних (рис. 3).
Таблиця 3
Порівняння результатів виявлення маркерів ЦМВ у крові паціентів після трансплантації нирки методами: тАГ, ШКМ та ПЛР
| № п/плейкоцитарних фракцій сироваток | Методи обстеження | ||
| ШКМ in vitro | тАГ | ПЛР | |
| антиген-позитивних клітин | антиген-позитивних клітин | ДНК | |
| 1 | - | - | + |
| 2 | - | - | + |
| 3 | 4 | - | + |
| 4 | - | - | + |
| 5 | 2 | - | + |
| 6 | - | - | + |
| 7 | 2 | - | + |
| 8 | 4 | - | + |
| 9 | 14 | - | + |
| 10 | 3 | - | + |
| 11 | 16 | 12 | + |
| 12 | 9 | 10 | + |
| 13 | 7 | 9 | + |
| 14 | 1 | - | + |
| 15 | 8 | 6 | + |
| 16 | 1 | 1 | + |
| 17 | - | - | + |
Примітка:
1. “+” - позитивний результат;
2. “-“ - негативний результат.
У 12 хворих співпадав позитивний результат при діагностиці ШКМ та ПЛР, що складало 70% (рис. 3). Трьома методами однакові результати було отримано тільки у 5-ти випадках, що складало 30%. Швидкий культуральний метод та метод прямої детекції АГ у 5-ти випадках виявляв кількість антиген-позитивних клітин, що супроводжувалось наявністю клінічних симптомів у хворих і може характеризувати інфекцію як гостру, в наслідок реактивації персистентної інфекції (усі пацієнти приймали раніше анти-ЦМВ терапію). У 5-ти інших хворих ШКМ та методом детекції антигенемії ЦМВ виділено не було, а ДНК методом ПЛР виявлялось. Це також пояснюється тим, що метод ПЛР є дуже чутливим, і виявляє ДНК вірусу навіть коли інфекція перебуває у персистентній формі.
Аналіз результатів дозволяє зробити висновок, що отримані нами дані вказують на високу ступінь співпадання результатів тесту на виявлення антигенемії та швидкого культурального методу, а також клінічними проявами ЦМВІ. Висока чутливість тесту на виявлення антигенемії дає можливість швидко діагностувати гостру форму ЦМВІ у пацієнтів після трансплантації нирки, до того ж антигенемія може бути виявлена протягом 3-4 год.
Таким чином, отримані дані по виявленню ранніх білків ЦМВ за допомогою нових швидких діагностичних методів показали їх діагностичну цінність і дозволяють застосовувати їх у медичних закладах. Ефективність швидкого культурального методу становила 70% у хворих після трансплантації нирки.
Дослідження антивірусної активності 6-аzaC. Вивчали цитотоксичність 6-azaC у культурі ФЛЕЛ за дією на життєздатність клітин використовуючи барвник трипановий синій. Було встановлено, що на 3-ю добу культивування клітин з 6-azaC у концентраціях від 50000 мкг/мл до 30000 мкг/мл життєздатних клітин у дослідах не спостерігалось. У присутності 6-azaC у концентрації 26000 мкг/мл кількість життєздатних клітин складала - 20% від контролю клітин, а при концентрації 20000 мкг/мл - 80%. 6-azaC у концентрації 10000 мкг/мл виявляв незначну цитотоксичну дію, кількість життєздатних клітин складала - 95%. Нижчі концентрації 6-azaC на життєздатність клітин протягом 3-х діб культивування не впливали. Отримані результати представлені на рис. 4. Життєздатність клітин у 100% зберігалася протягом 7-и діб у присутності у концентрації 2000 мкг/мл, і протягом 10-и діб при концентраціях речовини 500 мкг/мл – 100 мкг/мл. Розрахунки зроблені за графіком показали, що цитотоксична доза (СD50)6-azaC, тобто така, що не спричиняла незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин на 3-ю добу складала – 24000 мкг/мл.
Дослідження цитотоксичної дії 6-azaC на синтез ДНК клітин ФЛЕЛ показало, що у контрольній культурі через 1 добу 30% клітин перебували у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалася. Через 3-и доби кількість мічених клітин складала 12%.
Рис. 4. Цитотоксичний вплив 6-azaC на кількість життєздатних клітин ФЛЕЛ
по осі ординат- % життєздатних клітин від контролю клітин,
по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл
У культурі, обробленій 6-azaC концентраціями від 12000 мкг/мл до 240 мкг/мл, число клітин, із пригніченим синтезом ДНК через 1 добу незначно відрізнялось від контролю (рис. 5). Однак, через 3 доби число клітин, що синтезували ДНК, знизилось щодо контрольної популяції на 50% у присутності 2400 мкг/мл 6-azaC, а при концентрації 24000 мкг/мл практично на 100%. Отримані дані показують, що на 3-ю добу 50% зниження числа клітин, що синтезують ДНК, відбувалося при концентрації 6-azaC - 2400 мкг/мл.
Таким чином, було встановлено, що концентрація препарату що на 50% пригнічувала синтез ДНК і на 50% інгібувала приріст клітин (CD50) для 6-azaC становила - 2400 мкг/мл, і виявилася значно нижче концентрації, що впливала на життєздатність клітин – 24000 мкг/мл.
Дослідження антивірусної активності 6-azaC показало, що у терапевтичній схемі використання 6-azaC у концентраціях від 500 мкг/мл до 300 мкг/мл призводили до 100% пригнічення розвитку ЦПД вірусу при інфекційній множинності (ІМ) 0,001 БУО/кл і 0,0001БУО/кл. Аналіз дозозалежності дії 6-azaC показав, що 50% ефективна доза (ЕD50) при ІМ 0,001 БУО/кл складає 100 мкг/мл, при ІМ 0,0001 БУО/кл - 50 мкг/мл (рис. 6). При концентрації 6-azaC 10 мкг/мл і нижче інгібуючого ефекту не спостерігалось. ІS для 6-azaC у терапевтичній схемі при ІМ 0,001 БУО/кл складав 24, а при ІМ 0,0001БУО/кл – 48.
 |
Рис. 5. Цитотоксична дія 6-azaC на пригнічення синтезу ДНК клітин ФЛЕЛ
по осі ординат- % від контролю клітин, що синтезують ДНК,
по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл.
При дослідженні впливу 6-azaC на розвиток вірусної ЦПД у профілактичній схемі було встановлено, що при ІМ 0,0001 БУО/кл концентрації 10мкг/мл і 100 мкг/мл призводили до пригнічення вірусоспецифічної ЦПД на 70%, при 1000 мкг/мл - на 90%, при ІМ 0,001 БУО/кл концентрація 10 мкг/мл пригнічувала ЦПД вірусу на 13%, 100 мкг/мл і 1000 мкг/мл - на 30% і 33% відповідно (рис. 7).
Вивчення антивірусної дії 6-azaC показало, що препарат ефективно пригнічує репродукцію ЦМВ у культурі клітин при профілактичній схемі застосування. Було встановлено, що інгібуюча доза ED70, що відповідає концентрації 6-azaC, при якій спостерігалося 70% пригнічення утворення включень ЦМВ, становила 10 мкг/мл. ІS даного засобу при ІМ 0,0001 БУО/кл складав 240.
 |  |
| Рис. 6. Анти-ЦМВ активність 6-azaC у терапевтичній схеміпо осі ординат- % пригнічення формування включень від контролю вірусу, по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл | Рис. 7. Анти-ЦМВ активність 6-azaC у профілактичній схемі. по осі ординат- % пригнічення формування включень від контролю вірусу, по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл |
Дослідження впливу 6-azaC на синтез вірусних білків показав, що у концентраціях 100 мкг/мл і 1000 мкг/мл число клітин інфікованих ЦМВ, що містили білки р72 і рр65 у присутності сполуки 6-azaC практично не відрізнялось як від контрольної популяції клітин, так і від культури, обробленої ганцикловіром.