НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
НЕСІН ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ
УДК 577.352:612.73
ВЛАСТИВОСТІ КАЛЬЦІЙАКТИВОВАНИХ ТА
АТФ–ІНДУКОВАНИХ КАЛІЄВИХ СТРУМІВ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ ТAENIACAECI МОРСЬКОЇ СВИНКИ
03.00.02 - біофізика
Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2008
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий керівник:академік НАН України, доктор медичних наукпрофесорШуба Михайло Федоровичзав. відділом нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
Офіційні опоненти:доктор медичних наук, професорСоловйов Анатолій Івановичголовний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України;
доктор біологічних наук, професор Мірошниченко Микола Степанович зав. кафедри біофізики, біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка
Захист відбудеться “5” лютого 2008 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “5” січня 2008 р.
Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Основні функції кишечнику тісно пов’язані з його моторикою (сегментарне скорочення та перистальтичні хвилі), і забезпечується узгодженою роботою гладеньких м’язів поздовжнього та кільцевого шару стінки кишки. Моторна функція кишечнику надзвичайно важлива для процесів травлення та всмоктування поживних речовин. Вона забезпечує підвищення внутрішньокишкового тиску, що сприяє фільтрації розчинів з порожнини кишечнику до крові і лімфи та переміщення залишків хімуса за рахунок перистальтики по кишечнику. При багатьох патологічних процесах в травній системі відбувається порушення транзиту вмісту кишечнику. Ці порушення виступають головними причинами виникнення таких ускладнень, як післяопераційні парези, метеоризм, абдомінальний біль та запори. Тому гладенькі м’язи кишечнику є одним із важливих об’єктів дослідження фундаментальної та прикладної науки.
Питання, що стосуються механізмів регуляції тонусу, скорочення та розслаблення гладеньких м’язів з боку вегетативної нервової системи, були і залишаються центральними для фізіології, біофізики та фармакології м’язів. Одним з медіаторів гальмування інтестинальних гладеньких м’язів є аденозин-5’-трифосфат (АТФ), який викликає гіперполяризацію мембрани гладеньком’язових клітин (ГМК), пригнічення спонтанної активності і, як наслідок, розслаблення м’язів (Burnstock et al. 1963). Вперше пуринергічне гальмування вдалося заблокувати апаміном (токсин з отрути бджоли) у відділі Шуби М.Ф. (Владимирова, Шуба 1978). Пізніше в лабораторії Барнстока було показано, що апамін блокує калієву провідність мембрани (Banks et al. 1978). Вважається, що пуринергічне гальмування опосередковане активацією метаботропних пуринорецепторів (P2Y) і центральною ланкою цього гальмування є підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію за рахунок вивільнення його з внутрішньоклітинного інозитолтрифосфатного (IP3) кальцієвого депо та наступною активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності (SK) (Sanders et al. 1996).
Питання про типи кальційзалежних калієвих каналів (КСа) в мембрані цих клітин та можливої їх участі у пуринергічному гальмуванні залишається відкритим. Тому значний науковий інтерес викликає виділення компонентів кальційзалежного калієвого струму (ІК(Ca)) із сумарного трансмембранного іонного струму, дослідження їх фармако–біофізичних характеристик, а також визначення їх внеску у процеси пуринергічного гальмування гладеньких м’язів шлунково–кишкового тракту (ШКТ).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин”(№ держ. реєстрації 0198U001935), “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком’язових клітин нейромедіаторами”(№ держ. реєстрації 0101U002636) та “Мембранні та метаболічні механізми збуджувальної та гальмівної дії нейромедіаторів на гладенькі м’язи”(№ держ. реєстрації 0105U003235).
Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було виділення компонентів сумарного кальційзалежного калієвого струму і визначення їх внеску в пуринергічне гальмування кишечнику. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:
1. Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки із застосуванням антиоксидантних речовин.
2. Дослідити властивості кальційзалежного калієвого струму мембрани гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки, розділивши його на компоненти за допомогою паксиліну, ТЕА та d-тубокурарину,
3. Дослідити дію блокаторів кальційзалежних калієвих каналів (d-тубокурарину, паксиліну та ТЕА) на спонтанні вихідні струми.
4. Визначити компоненти кальційзалежного калієвого струму мембрани міоцитів при активації пуринорецепторів.
Наукова новизна роботи. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “whole-cell patch-clamp” було проведено розділення на компоненти інтегральних калієвих струмів та вивчення їх біофізичних та фармакологічних характеристик. Вперше виявлено блокуючу дію відомого нейротоксина d-тубокурарину на трансмембранні іонні струми та кальційзалежні калієві струми поодиноких свіжоізольованих ГМК кишечнику. Показано, що вихідні інтегральні трансмембранні іонні струми мають три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти ІК(Ca): ІК(Ca), що переноситься через SK канали та блокується d-тубокурарином і ІК(Ca), що переноситься через КСа канали великої провідності (BK) чутливі до дії паксиліну та ТЕА. Показано, що спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками та чутливістю до блокаторів можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС малої амплітуди чутливі до блокуючої дії d-тубокурарину і обумовлені активацією SК каналів, а СВС великої амплітуди блокуються паксиліном і ТЕА та формуються за рахунок активації BК каналів.
Дослідження клітинних механізмів пуринергічного гальмування показало, що основна роль належить активації кальційзалежних калієвих каналів малої провідності, внаслідок вивільнення Са2+ із інозитолтрифосфатчутливого кальцієвого депо саркоплазматичного ретикулуму.
Теоретичне та практичне значення роботи. Представлена робота має як фундаментальне так і практичне значення, оскільки значно поглиблює та розширює сучасні уявлення про клітинні механізми гальмування в гладеньких м’язах. В роботі проведено розділення вихідного трансмембранного іонного струму на потенціалзалежний та кальційзалежний компоненти, досліджено фармако−біофізичні характеристики кальційзалежних калієвих струмів. Виявлено клітинні механізми регуляції кальційзалежних калієвих каналів, при активації метаботропних пуринорецепторів. Результати досліджень можуть бути використані біофізиками, фізіологами та фармакологами для створення нових засобів корекції розладів ШКТ.
Особистий внесок. Всі електрофізіологічні дослідження вихідного інтегрального трансмембранного іонного струму та його компонент, спонтанних вихідних струмів, описаних в роботі, а також отримання функціонально повноцінних поодиноких ГМК, обробка експериментального матеріалу були виконані особисто автором. Аналіз та узагальнення результатів досліджень були обговорені з науковим керівником та співавторами публікацій.
Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на семінарах відділу нервово−м’язової фізіології та поточних наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (2002-2007), на міжнародній спеціалізованій школі нейронаук IBRO “Рецептори, канали, месенджери” (Ялта, 2004), Міжнародній науковій конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” (Харків, 2004), Міжнародній науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, (Львів, 2006), 4 з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).
Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в п’яти наукових статтях і п’яти тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 175 найменувань. Робота викладена на 111 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 39 рисунками та 2 таблицями.
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження було проведено на свіжоізольованих поодиноких ГМК поздовжнього м’язового шару сліпої кишки (taenia cаесi) морської свинки. Для виділення клітин шматочки taenia cаесi поміщали до 2 мл номінально безкальцієвого розчину, що містив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну, 2 мг соєвого інгібітору трипсину та 2 мг таурину (поглинач вільних радикалів) на 25 - 35 хв. при 34 оС. Оброблені таким чином шматочки taenia cаесi відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині.