В основній частині експериментів для дослідження іонних струмів ізольованих ГМК застосовувалась “whole-cell” конфігурація методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мікропіпетки виготовляли з м’якого молібденового скла, після заповнення розчином вони мали опір 2 - 4 МОм. Зовнішній розчин мав наступний склад (мМ): NaCl 120.4; КCl 5.9; CaCl2 2.5; MgCl2 1.2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO4 1; Na2ATФ 2; ЕГТА 0.3; HEPES 10; pH 7.3 (КOH). Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са2+ ([Ca2+]i) при використанні останнього розчину була близькою до фізіологічної і становила приблизно 100 нМ. При дослідженні Са2+ струму (ICa) іони К+ в розчинах еквімолярно замінювались на Cs+, також до зовнішнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонію (ТЕА). Експерименти проводились при кімнатній температурі (22-24 oC).
Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача “L/M ЕРС-5”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм “pCLAMP 5.5” та “Origin 5.0”.
Значення величин вказані як: середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного. В скобках вказано кількість клітин. Дані порівнювали за допомогою парного двохстороннього t-тест Стьюдента. Відмінності вважали статистично достовірними при значенні Р<0.05.
Результати дослiджень. Загальна характеристика Са2+залежних К+ струмів гладеньком’язових клітин taenia cаесі морської свинки. Для розділення та вивчення характеристик компонент ІК(Са), було використано неселективний блокатор К+ каналів – ТЕА, та відомий блокатор ВК каналів великої провідності – паксилін. В якості блокатора SK каналів було використано відомий нейромодулятор d-тубокурарин (d-ТК). Трансмембранні струми викликались за допомогою ступінчастих зміщень мембранного потенціалу від підтримуваного рівня – 60 мВ, що наближується до фізіологічного потенціалу спокою цих клітин. Типові значення вхідного опору клітин, що використовувались в наших експериментах, складали 1 - 2 ГОм. В досліджуваних клітинах при ступінчатих деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу –60 мВ тривалістю 250 мс, виникав вихідний струм з порогом активації –30 мВ. Аплікація паксиліну за таких експериментальних умов викликала значне пригнічення вихідного струму, також знижувались його осциляції. На рис. 1 показана дія паксиліну (100 нМ) на трансмембранний іонний струм. На цьому ж рисунку подана динаміка дії паксиліну на амплітуду вихідного струму. Ефект паксиліну досягав максимуму протягом 2 – 3 хвилин від початку його аплікації. Постійна часу дії паксиліну складала 1,3 ± 0,3 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину відбувалось з постійною часу 0,9 ± 0,1 хв (n=5).
На рисунку 2 показано вольт-амперну характеристику (ВАХ) паксилінчутливого ІК(Са), що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом відніманням значень струму при дії блокатора від контрольних значень.
На ВАХ паксилінчутливого ІК(Са) (рис. 2.А) спостерігається зміна крутизни “перегин” в районі максимуму активації ІСа, що дає змогу казати про залежність, цього струму від концентрації іонів Са2+ в середині клітини. Крім того, канали, через які переноситься паксилінчутливий ІК(Са), проявляли потенціалзалежні властивості. Зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалось збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са2+ в клітини при потенціалах +20…+40 мВ. На рисунку 2.Б показано криві нормалізованої провідності вихідного струму. Половина максимальної активації V0,5 в контролі складала 32.6±1.2 мВ, а коефіцієнт крутизни становив 12±0.7 мВ. При дії паксиліну ці значення становили 19.1± 0.9 мВ та 15± 0.6 мВ відповідно (n=7).
ТЕА − відомий неселективний блокатор калієвих каналів (Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). В концентрації 1 мМ ТЕА блокував вихідний струм, викликаний зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня –60 мВ до +50 мВ, більш ніж на 50±6 % (n=6). Паксилін, при додаванні його в концентрації 100 нМ до розчину ТЕА (1 мМ), не викликав додаткового зменшення вихідного струму (рис. 3.А). В той же час, додаткова аплікація ТЕА (1мМ) (рис. 3.Б) в присутності паксиліну, призводить до подальшого пригнічення вихідного струму.
Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), який переносяться через КСа великої провідності ефективно та однаково блокується наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСа каналів великої провідності призводить до меншого блокування, ніж ТЕА, і, відповідно, харибдотоксин.
В якості блокатора SК каналів було застосовано d-ТК, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів (Wenningmann et al. 2001) та широко застосовується як в дослідницьких цілях, так і в медицині. Але відомі інші дані про його додаткові властивості, як блокатора КСа каналів (Vacher et al. 1998, Ishii et al. 1997). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану міоцитів. Аплікація d-ТК (500нМ–1мМ) пригнічувала вихідний трансмембранний струм, викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня − 60 мВ, у концентраційно–залежний спосіб. З побудованої кривої доза-ефект, було встановлено, що концентрація половинного ефекту становить ІС50 = 38±5 мкМ (n=7).
На рисунку 4. подано динаміку дії d-ТК на амплітуду вихідного струму з часом. Часова розгортка дії d-ТК (50 мкМ) показала, що повний ефект блокування досягав максимуму через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладання блокатора. Постійна часу дії d-ТК складала 1 ± 0,2 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину 1,2 ± 0,2 хв (n=5).
Усереднені (n=9) ВАХ дії d-ТК на трансмембранний іонний струм наведено на рис 5. Як видно з рисунка, вклад d-TK чутливого струму в загальний вихідний струм на максимумі та в кінці деполяризуючого імпульсу, тривалістю 500 мс, був приблизно однаковим. Виходячи з динаміки кривої ВАХ можна зробити висновок, що канали, через які переноситься d-TKчутливий струм, не проявляють потенціалзалежних властивостей. Поряд з цим на ВАХ досить добре простежується максимум в районі +40 мВ, що не співпадає з максимумом ICa, котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ (рис 2). Подібні ефект було отримано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), що було, на думку авторів, пов’язано з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо.
В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100нМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнішнього розчину паксиліну викликало значне пригнічення вихідного струму (рис 6.А), та суттєво зменшувались осциляції. Додаткове додавання d-TK на фоні паксиліну викликало додатково незначне пригнічення вихідного струму. На рис 6. Б наведено дію d-ТК на вихідний струм. Як і в попередньому разі, d-ТК заблокував незначну частину вихідного струму, до того ж осциляції струму та його кінетика майже не змінилась. Додавання паксиліну до розчину в присутності d-ТК, призводило до значного пригнічення вихідного струму, при цьому значно зменшувались осциляції струму та його кінетика. Отриманні дані дозволяють зробити припущення, що паксилін та d-ТК діють на різні типи каналів незалежно один від одного. До того ж слід відмітити, що вклад паксилінчутливих каналів до загального вихідного струму значно більший, ніж вклад d-тубокураринчутливих каналів.
Властивості спонтанних вихідних струмів гладеньком’язових клітин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихідних струмів (СВС), та впливу на них блокаторів калієвих каналів. В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу виникали СВС, реєстрація яких проводилась протягом 100 с. СВС починали з’являтись при потенціалах більш позитивних ніж − 60 мВ (рис. 7). Як видно з рисунка, зі збільшенням мембранного потенціалу зростали амплітуда та частота зареєстрованих СВС.
СВС різної амплітуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звільнення Са2+ з внутрішньоклітинного депо, а також неоднорідності популяції кальційактивованих калієвих каналів. Як встановлено, в утворенні СВС приймають участь як ВК канали, так і SК канали. Окрім цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплітуди в більшості формуються за рахунок активації SК, в той час як СВС великої амплітуди − за рахунок активації ВК.
Дія блокаторів КСа каналів, d-ТК та ТЕА, на СВС (підтримуваний потенціал – 30 мВ) наведено на рис. 8. Аплікація d-ТК, як блокатора SК каналів, призводила до пригнічення СВС малої амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1мМ) як блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК призводило до пригнічення не тільки СВС великої амплітуди, але і залишкових СВС малої амплітуди. На рисунку 8.Б подано амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовірно, що СВС великої амплітуди мають в своєму складі d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SК канали. В той же час в формуванні СВС малої амплітуди приймає участь ТЕАчутливий компонент.
Ці дослідження показали, що СВС в ГМК taenia cаесі морської свинки є результатом відкривання ВК каналів, чутливих до дії паксиліну та ТЕА, та SК каналів, чутливих до дії d-TK.