Вплив антигістонових АТ на ріст і виживання клітин invitro. Оскільки анти-гістон Н1 антитіла, очищені із сироватки крові хворих на розсіяний склероз та із молока людини за антигенною специфічністю можна віднести до ауто-АТ, важливо було визначити їхній вплив на ріст і виживання клітин invitro. Мішенями тут слугували Т-клітини лінії Jurkat. Встановлено, що анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль і анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз відрізняються між собою за дією щодо цих клітин. Із рис.17 видно, що дія анти-гістонових sIgA-антитіл упродовж 72 год суттєво не вливає на ріст Т-клітин лінії Jurkat. У той же час, під впливом антигістонових IgG-антитіл спостерігався помітний приріст кількості цих клітин.
Отримані нами дані вказують на те, що анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть володіти промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Тому було припущено, що відмінність у дії антигістонових АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз та антигістонових АТ молозива породіль на Т-клітини лінії Jurkat може бути пов’язана із їхньою здатністю до інтерналізації. Підставою для цього припущення слугували дані про те, що IgG-антитіла, специфічні до деяких ядерних антигенів, можуть не лише проникати у клітини ссавців, але й транспортуватися в ядро цих клітин (Maetal., 1993; Avrameasetal., 1998).
Щоб перевірити цю гіпотезу, анти-гістонові-АТ обох ізотипів інкубували із Т-клітинами лінії Jurkat і визначали їхню субклітинну локалізацію за допомогою анти-IgG і анти-IgA антитіл, кон’югованих із пероксидазою хрону. Результати мікроскопії фіксованих препаратів клітин показали (рис.18), що після 2-годинної інкубації значна кількість анти-гістонових IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз потрапляє у цитоплазму клітин-мішеней
У той же час, присутність анти-гістонових sIgA-антитіл у клітинах була незначною. Здатність анти-гістонових IgG-антитіл інтерналізуватися у клітини ссавців було також підтверджено при використанні трансформованих фібробластів лінії L929 (рис. 19).
Отримані результати свідчать про те, що на відміну від анти-гістонових sIgA-антитіл молозива породіль, антигістонові IgG–антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть інтерналізуватися клітинами ссавців.
Зв'язок між стимулюючим ефектом анти-гістонових IgG на ріст лейкемічних лімфоцитів людини лінії Jurkatinvitro, їхньою протеолітичною активністю щодо гістону Н1 та здатністю до інтерналізації цих АТ дозволяє запропонувати гіпотезу про механізм активації проліферації клітин під дією цих антитіл. В основі цього механізму може лежати деконденсація хроматину, викликана гідролізом лінкерного гістону Н1 під впливом IgG-абзимів, які за певного функціонального стану клітин-мішеней можуть проникати в їхнє ядро.
Характеристика фосфотрансферазної активності АТ молозива породіль і сироватки крові хворих на СЧВ. Фосфорилювання білків і ліпідів є ключовими реакціями, задіяними у регуляції життєдіяльності клітин. Раніше нами було встановлено, що sIgAмолока жінок володіють спорідненістю до АТР і казеїнкіназною активністю (Kitetal., 1995). У наступних дослідженнях ми показали, що sIgA молока жінок також можуть володіти ліпідкіназною активністю. Ліпідкіназну активність антитіл було виявлено при аналізі продуктів фосфорилювання хроматографічних фракцій, отриманих гель-фільтрацією препаратів sIgA, очищених із молока жінок послідовними хроматографіями на протеїн А-агарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.7А).
Для дисоціації можливих імунних комплексів у препаратах sIgA гель-фільтрацію проводили у присутності 50 мМ NaOH (рис. 20А). Хроматографічний пік було розділено на 2 фракції і після нейтралізації рН було проаналізовано їхню протеїнкіназну активність. У sIgA–антитіл фракції 2 виявлено фосфорилювання секреторного компоненту (SC) і важких ланцюгів (Н)
цих імуноглобулінів (рис. 20В, доріжка 2). На відміну від фракції 2, у sIgA фракції 1, при низькому рівні фосфорилювання поліпептидів імуноглобулінів, спостерігали також утворення низькомолекулярного 32P-міченого продукту (рис. 20В, доріжка 1), який не фарбувався Coomassie (рис. 20Б, доріжка 1).На підставі даних було зроблено припущення, що виявлені нами фосфорильовані продукти належать до фосфоліпідів. Це припущення було підтверджене після екстракції цих продуктів розчином хлороформ-метанол (2: 1) і їхнім розділенням ТШХ у буферній системі, яку використовують для аналізу фосфоліпідів (рис. 20Г). Отже, sIgA-антитіла молока породіль можуть володіти як протеїнкіназною, так і ліпідкіназною активністю. При цьому ліпіди знаходяться у комплексі із імуноглобулінами і не дисоціюють при високих значеннях рН. На основі комбінованого аналізу цих сполук із застосуванням методів ензиматичної та хімічної деградації було зроблено висновок (Gorbunovetal., 2000, 2005), що субстратами каталізу sIgA-абзимів молока є 2 гліколіпіди, до складу яких входить один залишок сіалової кислоти та 4–5 залишків жирних кислот.
Результати наших досліджень показали, що ліпідкіназна активність властива також IgG-антитіламсироватки крові хворих на СЧВ (рис.21).
При електрофоретичному аналізі продуктів фосфорилювання препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на СЧВ хроматографією на протеїн А-сефарозі (рис.21Б, доріжка 1), як і у випадку sIgA-антитіл молока людини, спостерігали утворення низькомолекулярних 32Р-мічених сполук небілкової природи (рис.21В, доріжка 1), які також екстрагувалися із реакційного середовища розчином хлороформ-метанол (2: 1) і розділялися ТШХ на три фракції (рис.21Г, доріжка 1). Радіоактивно мічені продукти ліпідної природи було також виявлено при фосфорилюванні препаратів IgG(рис.21Г, доріжка 2), очищених на колонці із АТР-сефарозою (рис.21А). При цьому фосфорилювання ліпідів не спостерігалося у випадку, коли із [g-32P] ATP інкубували IgG, які не володіли спорідненістю до АТР (рис.21В, доріжка 2).
Отримані дані дозволяють припустити, що у сироватці крові хворих на СЧВ, подібно як у молоці людини, можуть бути присутні IgG-абзими, які володіють фосфотрансферазною активністю. Ми також припустили, що ліпіди можуть впливати на протеїнкіназну активність IgG-антитіл. Для перевірки цього припущення IgGпіддавали гель-фільтрації у буферній системі, яка містила 5% діоксану (рис.22). При інкубації IgG, очищених у такий спосіб від ліпідів, із [g-32P] ATP було виявлено включення 32Р у важкі (Н) і легкі (L) ланцюги IgG. При цьому рівень фосфорилювання їхніх поліпептидів значно зростав у випадку, коли до реакційної суміші додавали 1 мкМ нерадіоактивногоАТР.
Нами також проаналізовано, як впливає видалення ліпідів на рівень фосфорилювання АТ, очищених із молозива породіль і сироватки крові хворих на склеродермію. Встановлено, що руйнування комплексів ліпід-АТ гель-фільтрацією у присутності іонного розчинника діоксана стимулює фосфорилювання, не тільки IgG сироватки крові хворих на СЧВ, але й sIgA-антитіл молозива породіль і IgG-антитіл сироватки крові хворих на склеродермію. Очищені у такий спосіб від ліпідів препарати IgG здорових донорів не виявляли протеїнкіназної активності.
Отже у молоці клінічно здорових жінок і у сироватці крові хворих на СЧВ присутні абзими із фосфотрансферазною активністю. Характерною ознакою цих каталітично активних антитіл є їхня спорідненість до АТР і ліпідів. Висока спорідненість АТ до ліпідів дозволяє класифікувати виявлені абзими як антифосфоліпідні IgG. Підтвердженням цього можуть слугувати дані про те, що АТ із спорідненістю до фосфоліпідів можуть перехресно реагувати із АТР (Wasefetal., 1993; Chapmanetal., 2005). Можна припустити, що за рахунок конкуренції цих сполук за антиген-зв’язувальні ділянки молекул АТ відбувається перенос макроергічного гамма-фосфату молекули АТР на акцепторні групи ліпідів, і, можливо, білків. Крім того, не виключено, що фосфотрансферазна активність властива деяким ізотипам імуноглобулінів сироватки крові. На це вказують дані про те, що афінно-очищені IgA сироватки крові клінічно здорових донорів можуть фосфорилювати казеїн у присутності [g-32P] ATP. Для виявлення ділянок АТ, які залучені у фосфотрансферазну реакцію, ми використали комп’ютерний аналіз рівня гомології первинних структур білків імуноглобулінової надродини і відомих протеїнкіназ. За допомогою цього підходу було встановлено, що Fc-фрагменти імуноглобулінів містять послідовності, гомологічні до деяких протеїнкіназ. Отримані результати слугували поштовхом для дослідження протеїнкіназної активності рецептора Т-гелперних клітин СD4.
Протеїнкіназна активність rsCD4. Рецептор СD4 – це глікопротеїн, який розташований на зовнішній поверхні плазматичної мембрани Т-гелперів, задіяний в активації внутрішньоклітинних процесів у цих клітинах, і, крім того, спільно із рецептором (TCR) /CD3 бере участь у різних міжклітинних взаємодіях [Gay etal., 1987; Doyle and Strominger, 1987]. За своєю будовою рецептор СD4 належить до надродини імуноглобулінових білків і тому деякі властивості цього білка можуть бути спільними з ознаками ауто-АТ та абзимів (рис.23А).
Спочатку нами було проведено пошук амінокислотних послідовностей СD4 із найвищим рівнем гомології щодо відомих протеїнкіназ. Для такого аналізу використано банк генів протеїнкіназ KinBase та програму порівняння KinomBlastServer (www. kinase. com). Встановлено, що найвищим рівнем гомології до протеїнкіназ володіє послідовність довжиною 100 амінокислотних залишків, яка входить до структури двох імуноглобулінових доменів позаклітинної ділянки рецептора СD4. Отримані дані дозволили припустити, що позаклітинний фрагмент СD4 володіє протеїнкіназною активністю. Для перевірки цієї гіпотези було використано рекомбінантний розчинний рецептор rsCD4 (“Genentech”, США), послідовність якого гомологічна позаклітинному фрагменту СD4 (рис.23А). Аналіз протеїнкіназної активності rsCD4 показав (рис.23Б), що у присутності [g-32P] ATP відбувається фосфорилювання рецептора (доріжка 1). Фосфорилювання rsCD4 не відбувалося, коли білок попередньо прогрівали при 65 0С (доріжка 2) або коли до реакційної суміші додавали 3 мМ АТР (доріжка 3). Інкубація rsCD4 із [-32P] ATP також не призводила до його фосфорилювання (доріжка 4). Отримані дані вказують на те, що рецептор rsCD4 володіє протеїнкіназною активністю. Додатковим аргументом на користь цього можуть слугувати дані фосфорилювання казеїну коров’ячого молока у присутності rsCD4 та [g-32P] ATP (рис.23Б, доріжки 5, 6). Наступними дослідами було показано, що подібно до класичних протеїнкіназ, для фосфорилювання рецептора rsCD4 необхідною є наявність двовалентних катіонів. Їхній вплив на протеїнкіназну активність rsCD4 у порядку зростання виглядає наступним чином: Ca2+ > Zn2+> Mn2+> Ni2+> Mg2+ > Cu2+ >Co2+. Реакція фосфорилювання також інгібувалась діетилпірокарбонатом, що вказує на участь у каталізі залишків гістидину. Визначення амінокислотної специфічності фосфорилювання показало, що фосфорилювання казеїну за участю rsCD4 відбувається за залишками серину.