А. Д. Тяпкина, В. Д. Горичева
На живые организмы оказывают влияние различные факторы внешней среды. При экстремальных воздействиях, к которым относятся перегревание и переохлаждение организма, происходят изменения гомеостатических констант, и прежде всего относящихся к системе крови [1]. Лейкоциты, имеющие высокую реактивность, быстро включаются в реакции адаптации.
Целью проведенного исследования было комплексное изучение функциональных свойств лейкоцитов при перегревании и переохлаждении организма.
Материал и методы исследования
Опыты проведены на лабораторных белых крысах (90 животных) с исходной массой тела 330-400 г. В эксперименте было выделено 7 групп животных: две интактные, служившие контролем, и 5 экспериментальных: 1 группа - легкая степень теплового поражения, 2 - средняя степень теплового поражения, 3 группа - тяжелая степень теплового поражения, 4 группа - переохлаждение организма, 5 группа - переохлаждение организма в условиях алкогольной интоксикации. Три первых группы животных выдерживали в термокамере при t +400С без доступа к воде. Животных 4-й и 5-й групп подвергали охлаждению в воде температурой +15°С. Животным 5-й группы дополнительно вводили в пищевод через эластичный зонд этиловый спирт (30%) в количестве 1 мл на 100г массы тела.
Смешанную кровь для исследования брали путем декапитации у предварительно наркотизированных животных. Для предотвращения свёртывания использовали гепарин в количестве 10 ед/мл. Полученную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Собирали лейкоциты. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоническим буфером (раствор Дюльбекко). Отмытые клетки ресуспендировали и подсчитывали их концентрацию в камере Горяева.
Фагоцитоз
Для исследования поглотительной способности нейтрофилов использовали частицы латекса размером 0,8 мкм. Смесь лейкоцитов с латексом в соотношении 1: 50 инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин., встряхивая пробирку с лейкоконцентратом через каждые 5 мин. Затем в фиксированных метанолом и окрашенных азур-эозином мазках подсчитывали процент фагоцитирующих клеток (фагоцитарная активность, ФА) и среднее число поглощенных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ) [2].
Миграционная активность
Для постановки миграции под агарозой использовали классический вариант, описанный в многочисленных монографиях и статьях. Агарозу с добавлением культуральной клеточной среды 199 наслаивали на предметные стекла. Для оценки спонтанной миграции в агаровом геле с помощью пробойника вырезали одну лунку, в которую помещали суспензию лейкоцитов (7-10x105клеток). На втором стекле ставили реакцию индуцированной миграции. Для этого вырезали группу из двух расположенных на расстоянии, равном диаметру пробойника (2,5 мм), лунок: одну - для клеточной суспензии, вторую - для хемоаттрактанта. В качестве хемоаттрактанта использовалась свежая плазма крови. Стекла помещали во влажную камеру при 37°С в атмосфере воздуха с 5% содержанием СО2 на 2 часа, затем погружали в 2% раствор глутарового альдегида на 60 мин. После фиксации и удаления агарозы клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому. В обоих случаях для оценки локомоционной активности измеряли площадь распространения клеток и рассчитывали хемотаксический дифференциал - отношение изменений площади индуцированной миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции (%) [3].
Адгезионная способность
За основу проводимых манипуляций была взята методика, описанная Megе J.-L. с соавт. 40 мкл суспензии лейкоцитов помещали в капилляр с внутренним диаметром 0,56 мм, предварительно обработанный аутоплазмой. Клетки инкубировали во влажной камере при 370С в течение 60 мин. Дальнейшие процедуры были следующими. Клеточную взвесь осторожно удаляли из капилляра при напряжении сдвига около 0,1 Н/м2. Капилляр повторно заполняли раствором Дюльбекко и освобождали от содержимого при напряжении сдвига 30 Н/м2. Считали число клеток в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором (со средней силой сцепления) смыве. Из полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [4].
Результаты исследований и их обсуждение
В ходе исследований были получены следующие результаты.
Изменения поглотительной способности нейтрофилов в условиях гипертермии выявили поэтапное увеличение фагоцитарной активности и числа поглощенных частиц (табл. 1). Прирост изученных показателей по сравнению с контролем составил: 20 минут перегревания - ФА - 8%, ФИ - 7%; 75 минут - ФА - 16%, ФИ - 37%; 120 минут - ФА - 24%, ФИ - 52%. При охлаждении животных до состояния холодного наркоза фагоцитарная активность менялась незначительно (1%), а число поглощенных частиц возрастало (увеличение ФИ - 19%). Охлаждение в условиях алкогольной интоксикации негативно сказывалось на функциональной активности нейтрофилов: достоверно снижались оба показателя ФА - 10%, ФИ - 37% (табл. 2).
Таблица 1
Показатели фагоцитарной активности у животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Фагоцитарная активность(%) | Фагоцитарный индекс (отн. ед.) |
| Контроль | 75±1,7 | 7,5±0,4 |
| I группа животных | 81±0,8 * | 8,0±0,2* |
| II группа животных | 87±1,1 * | 10,3±0,3* |
| III группа животных | 93±0,7 * | 11,4±0,4* |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05).
Таблица 2
Показатели фагоцитарной активности у животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Фагоцитарная активность (%) | Фагоцитарный индекс (отн. ед.) |
| Контроль | 92,8±1,01 | 9,3±0,3 |
| IV группа животных | 91,5±1,03 | 11,1±0,46 ** |
| V группа животных | 84,1±1,28 ** | 8,0±0,49 * |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05);
** - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,01).
Неодинаково выраженные при различном действии температурного фактора и инвертированные при алкогольной интоксикации изменения фагоцитарной активности лейкоцитов отражают, видимо, специфические черты процесса, вызванного экстремальным агентом. Вероятно, в данном случае происходят гормональные и медиаторные сдвиги, а также изменяются чувствительность и сопротивляемость белых клеток крови.
Изменения миграционных реакций имели ту же направленность. Из приведенных данных (табл. 3,4) видно, что при средней степени теплового поражения спонтанная миграционная активность возрастала на 37%, а реакции хемокинеза в присутствии свежей сыворотки крови были менее выражены, чем у интактных животных. При охлаждении животных до признаков холодного наркоза миграционные реакции нейтрофилов практически не отличались от контроля, и сочетание охлаждения с дачей этилового спирта приводило к повышению хемотаксической активности.
Таблица 3
Миграционная активность лейкоцитов животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Площадь распространения клеток при спонтанной миграции (мм2) | Площадь распространения клеток при стимулированной миграции (мм2) | Хемотаксический дифференциал (%) |
| Контроль | 3,5±0,2 | 3,7±0,2 | 6,9±1,1 |
| I группа | 4,1±0,2* | 4,2±0,2* | 4,1±5,5* |
| II группа | 4,8±0,2* | 4,9±0,2* | 1,5±1,9* |
| III группа | 5,0±0,2* | 4,7±0,3* | -7,1±3,1* |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p< 0,05).
Таблица 4
Миграционная активность лейкоцитов животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Площадь распространения клеток при спонтанной миграции (мм2) | Площадь распространения клеток при стимулированной миграции (мм 2) | Хемотаксический дифференциал (%) |
| Контроль | 4,2±0,2 | 4,2±0,4 | 9,1±6,6 |
| IV группа животных | 4,6±0,2 | 4,6±0,3 | 4,5±10,2 |
| V группа животных | 4,7±0,3 | 5,6±0,3** | 22,8±7,4 |
Примечание: ** - достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p<0,01).
Изменения адгезионной способности лейкоцитов в условиях экзогенного перегревания носили фазный характер (табл. 5). Соотношение числа лейкоцитов с высокой и средней силой сцепления менялось в сторону увеличения последних. При охлаждении животных адгезионная способность лейкоцитов снижалась (56%) преимущественно за счет клеток с высокой силой сцепления. Сочетание охлаждения с дачей алкоголя приводило к возвращению числа адгезировавших клеток к уровню контрольной группы (табл. 6). Данный стабилизирующий эффект связан, по-видимому, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом.
Таблица 5
Изменение адгезионной способности лейкоцитов животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Доля неадгезировавших клеток (%) | Доля клеток со средней силой сцепления (%) | Доля клеток с высокой силой сцепления (%) |
| Контроль | 43,3±4,1 | 5,9±1,1 | 50,8±4,3 |
| I группа животных | 34,7±6,3* | 13,3±3,6 | 52,1±5,5 |
| II группа животных | 42,3±6,5* | 15,6±4,7 | 42,1±6,7 |
| III группа животных | 18,6±6,9* | 7,0±2,7 | 74,3±6,6 |
Примечание: * - достоверность различий с контролем, p<0,05.
Таблица 6
Изменения адгезионной способности лейкоцитов животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Доля неадгезировавших клеток (%) | Доля клеток со средней силой сцепления (%) | Доля клеток с высокой силой сцепления (%) |
| Контроль | 32,2±4,6 | 11,5±2,1 | 56,1±6,2 |
| IV группа животных | 50,3±3,.9 | 10,6±0,9 | 39,1±4,4* |
| V группа животных | 29,3±3,9 | 13,1±1,9 | 57,6±5,7 |
Примечание: ** - достоверность различий с контролем, p<0,01.