Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности

Макрофаги

вободные Резидентные

Перитонеальные Печеночные

Легочные

Активация– не толькоповышениеактивностии усилениеметаболизма,цитотоксичности,но и увеличениечисла вовлеченныхв процесс клеток.

Макрофаги

Активированные5% Интактные95%

Активация

Специфическая Неспецифическая

(спомощью Тх1 иАТ) (разл. фарм.препараты, ЛПС,токсины)

Модель наперитонеальныхМФ

Среда 199(пит.в-ва,

а/б, T=37°)

Регистрацияданных

Прямойвизуальныйподсчет
Оценкахемотаксисаметодом Бойдена
НТС-тест
Хемилюминесценция
Радиометрия
Ферментативныеметоды
Иммунологическиеметоды

Цитотоксичность

ЦЖ,Циклофосфамид(Активация)

ИЛ-1, ФНО, Ростовыефакторы, PGE2

Атипичные

клеткине

чувствительны

кданным агентам

Опыт схитозаном

МакрофагТ-лимфоцит

Усилениеконтактноговзаимодействиятимоцитов смакрофагами
ИЛ-2, ИФγ АктивацияМФ

Содержание

Краткийэкскурс висторию……………………………………………………………………………………………..2

Современноесостояниеучения офагоцитозе……………………………………………………………..5

Макрофагиперитонеальногоэкссудата какмодель

фагоцитоза и нарушений фагоцитарнойактивности…………………………………………….13

Получениемодели………………………………………………………………………………………………………….14

Методы регистрациирезультатов…………………………………………....................................................14

Некоторыемоделируемыепроцессы

СНИЖЕНИЕБАКТЕРИАЛЬНОЙАКТИВНОСТИПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ

МАКРОФАГОВМЫШЕИ В УСЛОВИЯХСОЧЕТАННОГО

ПРИМЕНЕНИЯСТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНАТИПА А ИЭНДОТОКСИНА………………………………………………17

ОТМЕНАУСИЛИВАЮЩЕГОФАГОЦИТОЗДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВ

СПОМОЩЬЮ ФРАГМЕНТОВАНТИТЕЛ ПРОТИВFc-РЕЦЕПТОРОВМАКРОФАГОВ……………………………...................................18

УСИЛЕНИЕС ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНАРЕАКЦИИ

КОНТАКТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯМАКРОФАГА СТИМОЦИТАМИ invitro…………………………………………………………..19

АКТИВАЦИЯФАГОЦИТАРНЫХКЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО

ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМИПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ………………………………………………………………………………20

АКТИВАЦИЯМАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИЕМСИНТЕТИЧЕСКОГОАНТИОКСИДАНТА………………………………………………22

_{ФАГОЦИТАРНАЯАКТИВНОСТЬМАКРОФАГОВ}

_{ПЕРИТОНЕАЛЬНОГОЭКССУДАТА МЫШЕЙ ДЕЙСТВИИПРЕПАРАТОВПЛАТИНЫ………………………………………………………}₂₃

ИЗУЧЕНИЕФАГОЦИТАРНОЙАКТИВНОСТИПЕРИТОНЕАЛЬНЫХМАКРОФАГОВВ

ОТНОШЕНИИYERSINIAPESTISС ДЕФЕКТНЫМИИ ПОЛНОЦЕННЫМИ FRA-ГЕНАМИ…………………………………………………25

ВЛИЯНИЕМОДИФИКАТОРОВБИОЛОГИЧЕСКОГООТВЕТА ПРИРОДНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯНА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮАКТИВНОСТЬМАКРОФАГОВ……………………………………………………………….26

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕМАКРОФАГИ КАКМОДЕЛЬ

ДЛЯИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛАСЫВОРОТКИКРОВИ……………………………………………………………………...29

ВЛИЯНИЕГАМК, ГОМК ИГЛУТАМИНОВОИ

КИСЛОТЫНА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬФАГОЦИТОВ……………………………………………………………………………32

Заключение……………………………………………………………………….……………………………………………………………33

Некоторыедругие моделиизученияфагоцитоза……………………………………………………………… 34

Литература…………………………………………………………………………………………………………………………………………36

Краткийэкскурс в историю

Более 100 летпрошло с моментаоткрытияфагоцитарнойтеории, созданнойнашим великимнатуралистом,лауреатомНобелевскойпремии И. И.Мечниковым.Открытие, осмыслениеявления фагоцитозаи формулированиев общих чертахоснов фагоцитарнойтеории былосделано им вдекабре 1882г. В 1883 г. он изложилосновы новойфагоцитарнойтеории в докладе«О целебныхсилах организма»в Одессе на VIIсъезде естествоиспытателейи врачей иопубликовалих в печати.Были впервыевысказаныосновные положенияфагоцитарнойтеории, которыеИ. И. Мечниковразвивал впоследующемна протяжениивсей своейжизни. Хотя самфакт поглощенияживыми клеткамидругих частицбыл описанмногими натуралистамизадолго доученого, однакотолько он далблестящеетолкованиеогромной ролифагоцитов взащите организмаот болезнетворныхмикробов.

Много позжек 70-летнему юбилеюученого коллегаи друг И. И. МечниковаЭмиль Ру напишет:«Сегодня, мойдруг, Вы наблюдаетедоктринуфагоцитозасо спокойнымудовлетворениемотца, дитякоторого сделалохорошую карьерув мире, но сколькобеспокойствоно Вамдоставило!Его появлениевызвало протестыи сопротивлениеи в течениедвадцати летВам пришлосьсражатьсяза него». Доктринафагоцитоза«...однаиз наиболееплодотворныхв биологии: онасвязала явлениеиммунитетас внутриклеточнымпищеварением,она объясниланам механизмвоспаленияи атрофии; онаоживила патологическуюанатомию, которая,не будучи всостояниидать приемлемоеобъяснение,оставаласьчистоописательной...Ваша эрудициятакая обширнаяи верная, чтоона служитвсему миру».

И. И. Мечниковутверждал, что«...иммунитетв инфекционныхболезнях долженбыть приписанактивной целлюлярнойдеятельности.Среди клеточныхэлементовфагоциты должнызанять первоеместо. Чувствительностьи подвижность,способностьпоглощатьтвердые телаи вырабатыватьвещества, могущиеразрушать иперевариватьмикробов — вотглавные факторыдеятельностифагоцитов. Еслиэти свойствав достаточноймере развитыи парализуютпатогенноедействиемикробов, тогдаживотное отприроды иммунно...когда фагоцитыне обнаруживаютналичия всехили одного изэтих свойствв достаточнойстепени, тоживотное восприимчивок инфекции...».Вместе с тем,если бактериальныепродуктывызывают уфагоцитовотрицательныйхемотаксисили, если приположительномхемотаксисефагоциты непоглощаютбактерий илипоглощают, ноне убивают их,— также развиваетсясмертельнаяинфекция. Решениефундаментальныхпроблем сравнительнойэмбриологиии биологии,приведшее ккрупнейшимоткрытиямученого,позволило И.И. Мечниковуустановить,что «фагоцитозчрезвычайнораспространенв животноммире... как насамой низшейступени животнойлестницы, например,у простейших,так и ...у млекопитающихживотных ичеловека... фагоцитыпредставляютсобой мезенхимальныеклетки».

И. И. Мечниковбыл в то же времяпервым, ктозанялся сравнительнымизучениемявления фагоцитоза.Внимание ученогобыло обращеноне только натрадиционныелабораторныеобъекты, но ина таких представителеймира животных,как дафнии,морские звезды,крокодилы,обезьяны.Сравнительноеизучение фагоцитозабыло необходимоИ. И. Мечниковудля доказательствавсеобщностиявлений поглощенияи разрушениячужеродногоматериалафагоцитирующимимононуклеарами,широкогораспространенияв природеизучаемой имформы иммунологическойзащиты.

Клеточнаятеория Мечниковасразу наткнуласьна сопротивление.Прежде всегоона была предложенав то время, когдабольшинствопатологоввидели в воспалительнойреакции, а такжев связанныхс ней микрофагахи макрофагахне защитную,а вредоноснуюреакцию. В товремя считалидаже, что, хотяфагоцитирующиеклетки действительноспособны поглощатьболезнетворныемикроорганизмы,это приводитне к разрушениювозбудителя,а к переносуего в другиечасти тела ираспространениюболезни. Такжев тот периодвремени интенсивноразвиваласьгуморальнаятеория иммунитета,основы которойбыли заложеныП.Эрлихом. Былиоткрыты антителаи антигены,были выявленымеханизмыгуморальнойустойчивостиорганизмапротив некоторыхпатогенныхмикроорганизмови их токсинов(дифтерия, столбняки др.). Как этони странно, нодва таких открытияне могли некотороевремя ужитьсявместе. Позднеев 1888 г. Наттоллнашел в сывороткенормальныхживотных вещества,токсичные длянекоторыхмикроорганизмов,и показал, чтотакие антибактериальныесвойства значительноповышаютсяв результатеиммунизацииживотного. Вдальнейшембыло обнаружено,что в сывороткеимеются дваразных вещества,совместноедействие которыхприводит клизису бактерий:термостабильныйфактор, затемидентифицированныйкак сывороточныеантитела, итермолабильныйфактор, названныйкомплементом,или алексином(от греч. aleksein - защищать).Ученик самогоМечникова Бордеописал лизисэритроцитовгуморальнымиантителамии комплементом,и большинствоисследователейстали соглашатьсяс Кохом, чтопобеду одержалигуморалисты.Мечников иего ученикиотнюдь несобиралисьсдаваться. Былипоставленыпростые опыты,в которых микробы,помещенныев маленькиймешочек изфильтровальнойбумаги, защищающийих от фагоцитов,сохраняли своювирулентность,хотя буквальнокупались втканевой жидкости,богатой антителами.В Англиисэр Элмрот Райти С. Р. Дугласпопыталисьпримиритьразличия междуэтими двумяшколами всвоих капитальныхисследованияхпроцесса опсонизации(от греч. opsonein -делать съедобным).Эти ученыеутверждали,что клеточныйи гуморальныйфакторы являютсяодинакововажными ивзаимозависимымив том отношении,что гуморальныеантитела,специфическиреагируя сосвоей мишенью- микроорганизмом,подготавливаютего к фагоцитозумакрофагами.

В 1908 г. Шведскаяакадемия удостоилаНобелевскойпремии по медицинесовместноМечникова -основателяклеточногонаправленияи Эрлиха - олицетворявшегогуморалистскиеидеи того времени.Они были удостоеныпремии в качестве«признанияих работ поиммунитету».

Заслуга Мечниковасостоит нетолько в созданииим гениальнойтеории.Еще ранее онначал изучатьзаразные болезничеловека идомашних животных:вместе со своимучеником Н. Ф.Гамалеей онизучал туберкулез,чуму рогатогоскота, искалспособы борьбыс вредителямисельскогохозяйства. К1886 г. относитсяодно из важнейшихсобытий в историирусской медицины.Летом этогогода в Одессеначала работатьсозданнаяМечниковыми его талантливымучеником Н. Ф.Гамалеей перваярусская бактериологическаястанция. Онсоздал в Россиикрупнейшуюнаучную школумикробиологов.Выдающиесяученые Н. Ф. Гамалея,Д. К. Заболотный,Л. А. Тарасевичи многие другиебыли ученикамиИ. И. Мечникова.Илья ИльичМечников умерв 1916 году, до концажизни занимаясьвопросамииммунологиии клеточногоиммунитета.А наука об иммунитетебыстро и стремительноразвивалась.В этот периодбыло необычайномного работи ученых, изучавшихфакторы внутреннейзащиты организма.

Периодс 1910 по 1940гг. былпериодом серологии. В это времябыло сформулированоположение оспецифичностии о том, что АТ являютсяестественными,высоковариабельнымиглобулинами.Большую роль здесь сыгралиработы Ландштейнера, который пришелв выводу, что специфичностьантител неявляется абсолютной.

С1905 появилисьработы (Сarrel, Guthrie)по трансплантацииорганов. В 1930г.К.Ландштейнероткрываетгруппы крови.Работами пофагоцитозу,бактериофагии, вирусам, патогенезучумы занимаетсяАмадей Боррель.Премия присужденаФ. МакфарлейнуБернету (1899 - 1985) иПитеру Медавару(1915 - Англия) «заоткрытиеприобретеннойиммунолотическойтолерантности».Медавар показал,что отторжениечужеродногокожного трансплантатаподчиняетсявсем правиламиммунологическойспецифичности,и в основе еголежат такиеже механизмы,как и при защитеот бактериальныхи вирусныхинфекций. Последующаяработа, которуюон провел вместес рядом учеников,заложила прочнуюоснову дляразвитиятрансплантационнойиммунобиологии,которая сталаважной научнойдисциплинойи в дальнейшемобеспечиламногие достиженияв области клиническойтрансплантацииорганов. Бернетопубликовалкнигу «Образованиеантител» (1941 г.).Со своим коллегой,Франком Феннером,Бернет утверждал,что способностьк иммунологическимреакциям возникаетна сравнительнопоздних стадиямэмбриональногоразвития и приэтом происходитзапоминаниесуществующихмаркеров «своего»у антигенов,присутствующихв данный момент.Организм впоследующемприобретаетк ним толерантностьи не способенотвечать наних иммунологическойреакцией. Всеантигены, которыене запомнились,будут восприниматьсякак «не свои»и смогут в дальнейшемвызыватьиммунологическийответ. Быловысказанопредположение,что любой антиген,введенный втечение этогокритическогопериода развития,будет затемвосприниматьсякак свой и вызыватьтолерантность,в результатечего не сможетв дальнейшемактивироватьиммунную систему.Эти идеи былидалее развитыБернетом в егоклонально-селекционнойтеории образованияантител. ПредположенияБернета и Феннерабыли подвергнутыэкспериментальнойпроверке висследованияхМедавара, которыйв 1953 г. на мышахчистых линийполучили четкоеподтверждениегипотезы Бернета- Феннера, описавфеномен, которомуМедавар далназваниеприобретеннойиммунологическойтолерантности.

В 1969г. одновременно несколькими авторами (Р.Петров,М.Беренбаум,И.Ройт) былапредложена трехклеточнаясхема кооперации иммуноцитовв иммунномответе (Т-, В-лимфоцитови макрофагов),определившаяна многие годыизучение механизмовиммунногоответа, субпопуляционнойорганизацииклеток системыиммунитета.

Существеннуюроль в этихисследованияхсыграли кинематографическиеметоды. Возможностьнепрерывногодинамическогоизучениямикробиологическихобъектов invivo и invitro в условиях,совместимыхс их жизнедеятельностью,визуализацияневидимых длячеловеческогоглаза электромагнитныхизлучений,регистрациякак быстрых,так и медленныхпроцессов,управлениемасштабомвремени и некоторыедругие характерныеособенностиисследовательскойкинематографииоткрыли большиеи во многихотношенияхуникальныевозможностидля изучениявзаимодействияклеток.

Представлениео фагоцитахза истекшеевремя подверглосьсущественнойэволюции. В1970 г. VanFurthи соавт. предложилиновую классификацию,выделяющуюМФ из РЭС вотдельнуюсистему мононуклеарныхфагоцитов.Исследователиотдали даньуважения И. И.Мечникову,пользовавшемусятермином«мононуклеарныйфагоцит» ещев начале XXвека. Фагоцитарнаятеория не стала,однако, неизменяемойдогмой. Непрерывнонакопляемыенаукой фактыизменили иусложнилипонимание техявлений, в которыхфагоцитозказался решающимили единственнымфактором.

Можно утверждать,что в наши днисозданное И.И. Мечниковымучение о фагоцитахпереживаетсвое второерождение, новыефакты значительнообогатили его,показав, какэто и предсказывалИлья Ильич,огромноеобщебиологическоезначение. ТеорияИ. И. Мечниковаявилась мощныминдукторомпрогрессаиммунологииво всем мире,большой вкладв него внеслисоветскиеученые. Однакои сегодня основныеположениятеории остаютсянезыблемыми.

Первостепенноезначение фагоцитарнойсистемы подтверждаетсясозданием вСША обществаученых, занимающихсяизучениемретикулоэндотелиальнойсистемы (РЭС),издается специальный«JournalofReticulo-EndothelialSociety».

В последующиегоды развитиефагоцитарнойтеории связанос открытиемцитокиновойрегуляциииммунногоответа и, конечно,изучения влиянияцитокинов наклеточный ответв том числе имакрофагов.На заре этихоткрытий стояли работы такихученых, как Н.Ерне,

Г. Келер,Ц. Милштейн.

В СССР бурныйинтерес к фагоцитами связаннымс ними процессаминаблюдалсяв 80-е годы. Здесьнеобходимоотметить работыА.Н.Маянского,изучавшеговлияния макрофаговне только всвете их иммуннойфункции. Онпоказал значениеклеток РЭС нафункционированиетаких органовкак печень,легкие, желудочно-кишечныйтракт. Работытакже проводилиА.Д. Адо, В.М.Земсков,В.Г.Галактионов,экспериментыпо изучениюработы МФ вочаге хроническоговоспаленияставил Серов.

Следуетсказать, чтов 90-е годы интереск неспецифическомузвену иммунитетаупал. Отчастиэто можно объяснитьтем, что всеусилия ученыхбыли в основномустремленык лимфоцитам,но особенно– к цитокинам.Можно сказать,что сейчаспродолжается«цитокиновыйбум».

Однако этони в коем случаене означает,что актуальностьпроблемы упала.Фагоцитозсоставляетпример тогопроцесса, интереск которому неможет пропасть.Будет открытиеновых факторовстимулирующихего активность,будут обнаруженывещества угнетающиеРЭС. Будут открытия,уточняющиетонкие механизмывзаимодействияМФ с лимфоцитами,с клеткамиинтерстиция,с антигеннымиструктурами.Особенно этоможет бытьактуальносейчас в связис проблемойопухолевогороста и СПИД’а.Остается надеяться,что в ряду открытий,начатых великимМечниковым,будут стоятьимена русскихученых.

СОВРЕМЕННОЕСОСТОЯНИЕУЧЕНИЯ О ФАГОЦИТОЗЕ

Основныеположения офагоцитах исистеме фагоцитоза,блестящесформулированныеИ. И. Мечниковыми разработанныеего ученикамии последователями,надолго определилиразвитие этоговажнейшегонаправлениябиологии имедицины. Идеяо противоинфекционномиммунитете,которая такувлекла современниковИ. И. Мечникова,сыграла решающуюроль в становленииклеточнойиммунологии,эволюции взглядовна воспаление,физиологиюи патологиюреактивностии резистентностиорганизма.Парадоксальнои вместе с темзакономерно,что учениео фагоцитозеначалось скрупных обобщенийи концепций,которые напротяжениимногих летдополнялисьфактами частногохарактера, малоповлиявшимина развитиепроблемы вцелом. Волнасовременнойиммунологическойинформации,изобилие изящныхметодов и гипотезнаправилиинтересы многихисследователейв сторону изучениялимфоцитарныхмеханизмовклеточногои гуморальногоиммунитета.И если иммунологибыстро поняли,что без макрофагаим не обойтись,то судьба другогокласса фагоцитирующихклеток — полинуклеарных(сегментоядерных)лейкоцитов— до недавнеговремени оставаласьнеясной. Толькотеперь можнос уверенностьюсказать, чтои эта проблема,сделав за последние5—10 лет качественныйскачок, прочноутвердиласьи успешно развиваетсяне толькоиммунологами,но и представителямисмежных профессий— физиологами,патологами,биохимиками,клиницистами.Изучениеполинуклеарныхфагоцитов(нейтрофилов)— один из немногихпримеров вцитофизиологии,а тем более виммунологии,когда числоисследованийна объекте«человеческогопроисхождения»превосходитколичестворабот, выполненныхв экспериментена животных.

Сегодняучение о фагоцитозе— это совокупностьпредставленийо свободныхи фиксированныхклетках костномозговогопроисхождения,которые, обладаямощным цитотоксическимпотенциалом,исключительнойреактивностьюи высокоймобилизационнойготовностью,выступают впервой линииэффекторныхмеханизмовиммунологическогогомеостаза.Противомикробнаяфункция воспринимаетсякак частный,хотя и важный,эпизод этойобщей стратегии.Доказаны мощныецитотоксическиепотенции моно-и полинуклеарныхфагоцитов,которые, кромебактерицидности,находят выражениев уничтожениималигнизированныхи иных формпатологическиизмененныхклеток, альтерациитканей принеспецифическомвоспалениив иммунопатологическихпроцессах. Еслинейтрофилы(доминирующийтип полинуклеаров)почти всегданацелены надеструкцию,то функциимононуклеарныхфагоцитовсложнее и глубже.Они участвуютне только вразрушении,но и в созидании,запускаяфибробластическиепроцессы ирепаративныереакции, синтезируякомплексбиологическиактивных субстанций(факторы комплемента,индукторымиелопоэза,иммунорегуляторныебелки, фибронектинипр.). Сбываетсястратегическийпрогноз И. И.Мечникова,который всегдасмотрел нафагоцитарныереакции собщефизиологическихпозиций, утверждаязначение фагоцитовне только взащите от «вредныхдеятелей», нои в общей борьбеза гомеостаз,которая сводитсяк поддержаниюотносительногопостоянствавнутреннейсреды организма.«При иммунитете,атрофии, воспалениии излечении,во всех явлениях,имеющих величайшеезначение впатологии,участвуютфагоциты».

Мононуклеарныефагоциты, которыеранее относилик ретикулоэндотелиальнойсистеме, выделеныв самостоятельноесемействоклеток — системумононуклеарныхфагоцитов,которая объединяетмоноциты костногомозга и крови,свободные,и фиксированныетканевые макрофаги.Доказано, что,выходя из крови,моноцит меняется,адаптируяськ условиям тойсреды, в которуюпопадает. Этообеспечиваетспециализациюклетки, т. е.максимальноесоответствиетем условиям,в которых ейпредстоит«работать».Не исключенаи другая альтернатива.Подобие моноцитовможет бытьчисто внешним(как это случилосьс лимфоцитами),и часть из нихпредетерминированак трансформациив различнеевариантымакрофагов.Гетерогенностьзрелых нейтрофиловхотя и существует,но выраженагораздо слабее.Они почти неменяютсяморфологически,попадая в ткани,в отличие отмакрофаговживут тамнедолго (неболее 2—5 сут)и явно не обладаютпластичностью,присущей моноцитам.Это высокодифференцированныеклетки, которыепрактическизаканчиваютсвое развитиев костном мозге.Не случайно,известные впрошлом попыткиотыскать корреляциюмежду сегментациейядра и способностьюлейкоцитовк фагоцитозуне увенчалисьуспехом. Темне менее идеяо функциональнойнеоднородностиморфологическизрелых нейтрофиловпродолжаетполучатьподтверждения.Известны различиямежду нейтрофиламикостного мозгаи периферическойкрови, нейтрофиламикрови, тканейи экссудатов.Причины ифизиологическийсмысл этихособенностейнеизвестны.По-видимому,изменчивостьполинуклеаровв отличие отмоноцитов-макрофаговносит тактическийхарактер.

Изучениефагоцитозаведется согласноклассическимпостулатамИ. И. Мечниковао фазах фагоцитарнойреакции —хемотаксису,аттракции(связывании)и поглощении_,уничтожении(переваривании).К характеристикекаждого из этихпроцессов внастоящее времяприковановнимание, импосвящаютмонографии,обзоры. Результатымногочисленныхисследованийпозволилиуглубитьсяв суть этихреакций, конкретизироватьмолекулярныефакторы, лежащиев их основе,нащупать общиеузлы и вскрытьчастные механизмыклеточнойреактивности.Фагоцитозслужит прекрасноймоделью дляизучениямиграционнойфункции, пространственнойориентацииклеток и ихорганелл, слиянияи новообразованиямембран, регуляцииклеточногогомеостазаи других процессов.Иногда фагоцитознередко отождествляютс поглощением.Это явно неудачно,ибо нарушаетисторическисложившеесяпредставлениео фагоцитозекак об интегральномпроцессе, которыйобъединяетсумму клеточныхреакций, начинаяс распознаванияобъекта и кончаяего разрушениемили стремлениемк разрушению.С функциональнойточки зренияфагоциты могутпребывать вдвух состояниях— покоящемсяи активированном.В наиболееобщем видеактивация —есть результатпреобразованиявнешнего стимулав реакцию эффекторныхорганелл. Большепишут об активированноммакрофаге, хотяв принципето же самоеможно сделатьи для полинуклеаров.Надо выбратьлишь точкуотсчета — кпримеру, функциональныйстатус в сосудистомрусле нормальногоорганизма.Активацияразличаетсяне только степеньювозбужденияиндивидуальныхклеток, но имасштабомохвата клеточнойпопуляции вцелом. В нормеактивированонебольшоеколичествофагоцитов.Появлениераздражителярезко меняетэтот показатель,отражая подключениефагоцитов креакциям,корригирующимвнутреннююсреду организма.Стремлениепроактивироватьфагоцитарнуюсистему, усиливтем самым ееэффекторныевозможности,неоднократнозвучало в работахИ. И. Мечникова.Современныеисследованияпо адъювантам,биологическими фармакологическиммодулятораммононуклеарныхи полинуклеарныхфагоцитовпо существуразвивают этумысль с позициймежклеточнойкооперации,общей и частнойпатологии.В этом видитсяперспективарациональноговоздействияна воспаление,репаративныеи регенеративныепроцессы,иммунопатологию,резистентностьк острому ихроническомустрессу, устойчивостьк инфекциям,опухолям и пр.

Многиепризнаки активациистереотипны,повторяясьу всех фагоцитирующих клеток. К ним относятсяизменениеактивностилизосомальныхи мембранныхферментов,усилениеэнергетическогои окислительногометаболизма,синтетическихи секреторныхпроцессов,изменениеадгезивныхсвойств и рецепторнойфункции плазматическоймембраны, способностик случайноймиграции ихемотаксису,поглощениюи цитотоксичности.Если учесть,что каждая изэтих реакцийпо своей природеинтегративна,то количествочастных признаков, по которым можно судитьо возбужденииклеток, будетогромным.

Один и тотже раздражительспособен индуцироватьвсе или большинствопризнаковактивации.Однако это,скорее, исключение,чем правило.Сегодня многоеизвестно оконкретныхмеханизмах,реализующихэффекторныесвойства монои полинуклеарныхфагоцитов.Расшифрованаструктурнаяоснова двигательныхреакций, открытыорганеллы,обеспечивающиевекторнуюориентациюв пространстве,изучены закономерностии кинетикаобразованияфаголизосом,установленаприрода цитотоксичностии бактерицидности,определенысинтетическиеи секреторныепотенции, обнаруженырецепторныеи каталитическиепроцессы вплазматическоймембране и пр.Становитсявсе более очевидным,что дискретныепроявленияклеточнойреактивностиобеспечиваютсяили по крайнеймере инициируютсяобособленнымимеханизмамии могут возникатьнезависимодруг от друга.Удаетсяподавить илиусилить хемотаксис,не изменивспособностик поглощениюи цитотоксичности,секреция несвязана споглощением,повышениеадгезивностине зависит отпотреблениякислорода ит. д. Известныгенетическиедефекты, когдавыпадает однаили несколькоиз перечисленныхфункций, причеммногие из нихстереотипныпо клиническойсимптоматике.Если к этомуприсовокупитьпатологиюмедиаторныхсистем, генерирующиххемоаттрактантыи опсонины,станет понятно,насколькосложным иодновременноконкретнымдолжен бытьсегодня диагноз,констатирующийнарушениефагоцитоза.

Крупнымсобытием явилосьутверждениемолекулярныхоснов цитотоксичности (в том числебактерицидности) и ее отношенияк реактивностиклеток. Стремлениепонять сущностьреакций, приводящих к гибели поглощенных бактерий,проглядываетв большинстверабот И. И. Мечникова.Многие годы эта проблематрадиционносводилась к«перевариванию»,в котором участвуют гидролитические ферменты (цитазы, по И.И. Мечникову),определяющие,как полагали,антимикробныесвойства фагоцитов.Эта позициябыла сильнопоколеблена,после того какоказалось, что лизосомальные гидролазы обладают слабойбактерицидностьюinvitro или лишеныее. В основу современных взглядов положенынаблюдения, свидетельствующиеоб усиленииокислительногометаболизма активированныхфагоцитов иразобщении двух главных событий —киллинг-эффектаи деградации убитых, нежизнеспособных объектов. Прежняятерминология, в которой закрепленапричинная связьмежду уничтожениемживой мишении переваривающейфункцией клетки, оставлена.Переваривание,которое обусловленокислыми инейтральнымигидролазами,преформированнымив гранулах,является вторичными нацелено наобъекты, убитыезависимымии независимымиот кислородамеханизмами— биооксидантами, системой миелопероксидазы,катионными белками, лактоферрином,лизоцимом.Реализацияцитотоксичностиотражает реактивноевозбуждение фагоцитирующих клеток, которыесекретируютэффекторныемолекулы внутрьфагосом (собразованием фаголизосом) либо наружу,атакуя внеклеточные (непоглощенные)объекты. То,что количествокислорода,поглощаемоголейкоцитами,значительноувеличиваетсяпри фагоцитозе,известно давно.Однако истинноезначение этогофеномена, которыйв современнойлитературечасто называютреспираторным,или метаболическим,взрывом, осмысленолишь в последниегоды. В отличиеот многих клетоккислородноедыхание неявляется системойжизнеобеспеченияфагоцитов —они хорошопереносятгипоксию ивыполняют рядфункций в условияханаэробиоза.При помощиреспираторноговзрыва моноциты-макрофагии нейтрофилырешают чистоэффекторныезадачи, «вооружаясь»против микробови других объектов,которые воспринимаютсяими как антигомеостатическиефакторы. В анаэробнойсреде фагоцитысохраняютспособностьк поглощению,но резко снижаюттоксичностьв отношениимногих патогенныхи условно-патогенныхбактерий. Ключевоймеханизм сводитсяк активациимембранныхоксидаз, катализирующихперенос электроновс НАДФН намолекулярныйкислород. Этостимулируетокислениеглюкозы вгексозомонофосфатномшунте, приводяк гиперпродукцииперекиси водородаи свободныхрадикаловкислорода -биологическихоксидантовс мощнымицитотоксическимипотенциями.Клиническоезначение подобныхреакций сталоочевиднымпосле того, какбыло обнаруженофатальноеснижениепротивоинфекционногоиммунитетау детей с врожденнойпатологиейсистемы респираторноговзрыва нейтрофилов.Впрочем, былобы невернопротивопоставлятьразличныеантимикробныефакторы. Ихэффективностьво многом зависитот взаимнойсбалансированностиусловий, в которыхпроисходитфагоцитоз, видамикроба. Нейтрофилы,лишенные возможностииспользоватьбактерицидныесвойстваактивированногокислорода, темне менее нормальноубивают эпидермальныйстафилококк,синегнойнуюпалочку, зеленящийстрептококк,облигатныеанаэробы.Относительнаяустойчивостьк фагоцитозуопределяетсясуммой признаков— поверхностнымисвойствамимикробнойклетки, наличиемфакторов типалейкотоксинови антифагинов,инактивациейбиооксидантови пр. Давнообнаруженаспособностьнекоторыхбактерийтормозитьобразованиефаголизосом. Этот механизм,который исключаетконтакт сцитотоксическимикомпонентамифагоцитов,обеспечиваетдлительноеперсистированиев макрофагахтуберкулезнойпалочки, aв нейтрофилах— бруцелл, атакже другихмикроорганизмов.Одну из причинвидят в повышениивнутриклеточногоуровня циклическогоаденозинмонофосфата,блокирующегомобилизациюгранул и ихслияние с фагосомами.Этот примерпоказывает,насколькоглубокими могут быть взаимоотношения, которые складываютсяв процессефагоцитоза.

Становлениевзглядов намеханизмыцитотоксичностифагоцитов неподорвало мечниковскойконцепции оцитазах како медиаторах,опосредующихдеструктивные функции клеток.И. И. Мечниковне раз подчеркивал,что, кроме разрушениямикробов, фагоциты способны повреждатьсобственныеткани. Эти идеиполучили блестящееразвитие всовременныхработах поферментологиилизосомальныхгранул и способамих подключенияк фагоцитарным реакциям. Вгранулах моно-и полинуклеарных фагоцитовидентифицированбольшой арсеналгидролитическихферментов (нейтральных и кислых гидролаз),для каждогоиз которыхможно подыскатьмишень вовнеклеточномпространстве.Под их прицеломнаходятсяколлагеновыеи эластиновыеволокна, пептидогликановый матрикс хряща,фибронектин,факторы комплемента,системыкалликреин-кининов,свертывания,фибрино-лиза,иммуноглобулины,клеточныемембраны. Впротивовесстарым представлениямсегодня сделанакцент на активном,секреторномвысвобожденииэффекторных молекул, котороезначительноповышает эффекторнуюпластичностьклетки, позволяяв кратчайшийсрок мобилизоватьи рациональноиспользоватьсвои возможностив физиологических ситуациях ив ходе разнообразных патологических процессов.Секретируя,фагоциты воздействуют на другиемедиаторныесистемы и разрушаютвнеклеточныеобъекты, размеркоторых исключаетвозможностьпоглощения.Так, по-видимому,обстоит делопри эмфиземелегких, в реакцияхна иммунныекомплексы, приостром и хроническомвоспалении.Кроме гидролази других компонентовлизосомальныхгранул, активированныефагоцитывыделяют пирогены,интерфероныи интерфероноподобныевещества,простагландины,тромбоксаны,биооксиданты,монокины, факторы,стимулирующие предшественники миелопоэзаи пр. Лейкотриены вызывают сокращениегладких мышци повышениесосудистойпроницаемости,действуя в 100—10000 раз сильнее,чем гистамин.

Прав былИ. И. Мечников,когда говорило широком спектрезадач, решаемыхфагоцитами,и многообразииих функциональныхконтактов(«живой цепи»,по И. И. Мечникову)с другими клеткамии тканями.Активированныемакрофаги инейтрофилыслужат однимиз самых яркихпримеров экстренноймобилизацииэффекторныхмеханизмовс обширнойсферой приложенияв масштабе нетолько соединительнойткани, но и всегоорганизма.

Активаторымоноцитов-макрофагови полинуклеаровобразуютсяв системахкомплемента,свертывания,фибринолиза,калликреин-кининов,иммуноглобулинов,выделяются лимфоцитами,фибробластами,тромбоцитами, эндотелием.Сложные взаимоотношенияскладываютсяи внутри самойфагоцитарной системы. Моноцитарныйинфильтрат при воспаленииформируетсяпод влияниемхемоаттрактантов,продуцируемых нейтрофилами, которые первымимигрируют взону альтерации.В свою очередьмоноциты имакрофагивыделяют факторы,избирательно активирующие нейтрофилы.Существенноезначение имеетфункциональнаякооперациямежду однотипными фагоцитами,которая предполагает участие«аутокаталитических»механизмов,контролирующих миграционную,секреторнуюи другие функцииактивированныхклеток. Липоксигеназныеметаболиты арахидоновой кислоты — различныеварианты гидроксиэйкозантетраеновые кислоты хемотаксичныв ничтожныхдозах (особеннодля нейтрофилов)и, являясьпотенциальными«осколками»клеточногометаболизмаунифицируютсигналы, которыеобеспечиваютнаправленнуюмиграцию фагоцитовв очаги тканевого повреждения.Любая травмалюбой ткани может стать инициаторомподобных реакций.В этом прослеживаетсяодин из универсальных механизмов гомеостаза— внутри популяциифагоцитов, вмасштабесоединительнойткани, за еепределами.

Из сказанногоследует важныйвывод. Трудноподыскать такоеизменениевнутреннейсреды организма,которое бы нефиксировалосьсистемой фагоцитоза.Являясь мощнымиэффекторами,фагоциты превращаютсяв узел связи,своего рода стратегическуюмишень, черезкоторую трансформируютсявсе реакциикрови и соединительнойткани. Особеннопоказательнынейтрофилы.Обмениваясьв циркуляциикаждые 5 ч, оникак бы фотографируютсдвиги, которыепроисходятв течение этогопериода, являясьсвоеобразнымзеркаломгомеостаза.Не случайно,что индикаторныетесты, основанныена высокойреактивностиполинуклеаров,давно используютсяв клинике и поинформативностинередко превосходятдругие гематологическиепоказатели.

Много вниманияуделяетсямолекулярныммеханизмамактивациифагоцитов. Всоответствиис общими принципамисовременнойцитофизиологиисхема фагоцитарнойреакции предусматриваетраспознаваниеи рецепцию(связывание)внешнего сигнала,реактивныеизменения вплазматической мембране, активацию внутриклеточныхсигналов-посредников, функциональную трансформациюэффекторныхорганелл. Открытиестимуляторовс известнойструктуройпривело к заключение,что их воздействиена фагоцитыопосредуетсячерез дискретные участки плазматической мембраны —специфическиерецепторы,которые по молекулярнойконфигурациикомплементарныстимулирующему агенту. Это определяет важнейшеесвойствоплазматическоймембраны —дифференцироватьмолекулярный профиль внешних раздражителейи трансформировать его в определеннуюформу клеточногоответа. Макрофагии нейтрофилы рецептируют Fc-фрагментIgG-и IgA-иммуноглобулинов,производныекомплемента(СЗЬ, C3d,СЗе, С5а, С567), различныехемоаттрактанты, пектины, бактериальныегликопротеиды, фибронектин, адрен- и холинергическиеагенты, гистамин, кортикостероиды, эстрогены ипр. Вместе ониопределяютфармакологический профиль,

т. е реактивность клетки к соответствующему набору функциональных модуляторов. Выясняется,что рецепторныйаппарат — весьмадинамичная система. Имеяопределенный стартовый уровень, онаменяется взависимостиот конкретной обстановкии состоянияклеток. Интенсивность специфической рецепции является однойиз самых интересныхформ реактивности,управлениекоторой позволитвоздействоватьна наиболееранние этапыфагоцитарногопроцесса.Принципиально,что экспрессияразных рецепторов меняется несинхронно, дифференцируетсяфармакологическимиагентами иприводит кнеодинаковымфункциональным последствиям.Пассивная почисто внешнимпризнакам (кпримеру, хемоаттрактантысвязываютсяразрушеннымиклетками) рецепциясопровождаетсямолекулярнымисдвигами вплазматическоймембране, многиеиз которыхиграют ключевуюроль в активацииклетки. Одиниз постулатовсовременнойцитофизиологии,утверждающийфункциональноеили даже структурноеединство рецепторови ферментовплазматическоймембраны(эктоферментов),нашел отражениеи в исследованияхпо фагоцитозу.В составеплазматическоймембраны фагоцитовобнаруженысеринэстеразы,протеиназы,аденилатциклазы,оксидазы, АТФ-азы.Полагают, чтоони активируютсяпри стимуляции,воспринимаяизменения молекулярнойтопографииклеточнойповерхности.Ферментологияплазматическоймембраны отражает стремлениепонять механизмы, инициирующие переключениеэнергии раздражения в энергию клеточноговозбужденияПоиски универсальногофермента-инициаторане оправдались,что, скорее,говорит о спецификеразличных форм клеточной реактивности, нежели отрицает саму идеюэктоферментногоопосредования.Не увенчалисьуспехом и поискиуниверсальногомедиаторного звена между реакциями плазматическоймембраны иэффекторнымиорганеллами.На эту рольпретендовали циклические нуклеотиды,Са²+, производные активированного кислорода.Каждый из нихконтролируетболее или менеесложный набор клеточных функций, но вцелом их эффектнеуниверсален.Напротив, естьфакты, которыеубеждают, что внутриклеточноеопосредованиеможет быть полидетерминантным,т. е. зависитот совместного действия несколькихмедиаторов.Именно такоесочетаниеопределяетконечную формуответа и свойственнобольшинствуфагоцитарныхреакций. По последним данным, механизмы, обеспечивающиевыход на однии те же органеллы, могут бытьнеодинаковыдля разныхстимуляторов.Глубокое развитиеполучили идеиИ. И. Мечниковаи его современниковоб опсонинах,сыгравшиенекогда решающуюроль в объединенииклеточных игуморальныхконцепций иммунитета. Понятие об опсонинах сформулировано в 1903 г., а усилениефагоцитоза в сывороточнойсреде замеченоеще раньше.Однако лишьпоследниедесятилетияознаменовалось радикальнымиуспехами визучении молекулярныхоснов опсоническойфункции и еереализации на уровнеклеток-эффекторов.К семействуопсонинов обычно относят четыре группыхорошо охарактеризованных сывороточныхбелков — IgG,СЗ (СЗЬ), фибронектин,С-реактивныйбелок, однаков действительностиих, очевидно,больше. Наиболееуниверсальнымисвойствами обладают СЗЬ-и IgG-антитела.Кооперируясьдруг с другом,они создаютмощный опсоническийзаслон, которыйтрадиционносчитается однимиз главныхфакторовпротивоинфекционногоиммунитета.Функции другихопсонинов,по-видимому,более ограниченны,их активностьсильнее зависитот свойствфагоцитируемогообъекта и типафагоцитов.Именно неоднородностьсубстратов,с которымиприходитсясталкиватьсяфагоцитирующимклеткам, следуетсчитать первопричинойэволюционнозакрепленнойгетерогенностиопсоническихфакторов.

Проблемаопсониновгораздо шире,чем противомикробнаязащита. В наиболееобщем виде онасводится кфокусированиюклеточныхреакций налюбых объектахэкзогенногои эндогенногопроисхождения,которые, попадаяво внутреннююсреду, вступаютв противоречиес гомеостазом.Кроме уничтожениямикробов, опсонизацияспособствуетудалению продуктовтканевогораспада, разрушениюмалигнизированныхи инфицированныхвирусами клеток,гибели одноклеточныхи многоклеточныхпаразитов,элиминацииантигенов,прочно связанныхс базальнымимембранамии другими тканевымисубстратами.Опсоническиереакции, каки фагоцитозв целом,— явление,безусловно,физиологическое.Но это тот случай,когда о значенииэффекторныхмеханизмовудается судитьпо их поведениюв патологическихситуациях. И.И. Мечниковутверждал, чтодействие опсониновне ограничиваетсяулучшениемфизическихконтактов междуобъектом ифагоцитирующейклеткой. По егомнению, опсониныне только меняютповерхностныесвойствафагоцитируемыхчастиц, но истимулируютфагоциты. Естьоснованиясчитать опсонинысвоеобразнымифармакологическимиагентами, которыестимулируютклетки независимоот поглощенияпо сигналу срецепторовплазматическоймембраны, вошедшихв контакт сопсонизированнойповерхностью.В составеFаb-фрагментаIgGобнаружентетрапептид— тафтсин (вчесть Тафтскогоуниверситетав США), которыйв незначительныхдозах усиливаетмногие функцииполи- и мононуклеарныхфагоцитов.Справедливостьидеи о стимулинахстановитсяеще очевиднее,если изучатьне изолированныесистемы фагоцит— опсонизированныйобъект, а реальныеситуации, возникающиев организме.Многочисленныенаблюденияпоказывают,что на объектыфагоцитозанельзя смотретькак на пассивныесорбенты опсоническихфакторов. Процессопсонизациисопровождаетсяреакциями вразличныхсистемах гуморальногогомеостаза,что приводитк гиперпродукциибиологическиактивныхвеществ, прямоили косвенновлияющих

на клеточнуюреактивность.Это отчетливопрослеживаетсяна примерекомплемента.НаработкаСЗ-опсониновсвязана с егокаскаднойактивациейи сочетаетсяс образованиемС5а — одногоиз самых мощныхэндогенныхстимуляторовфагоцитоза.

Важен вопрособ отношениифагоцитозак приобретенному(специфическому)
иммунитету.Классическийпостулат И. И.Мечниковао перевариванииантигенного материалафагоцитамикак необходимомэтапе образованияантител трансформировалсяв современнуюконцепциюо предъявленииантигенныхдетерминантТ-лимфоцитамв виде комплексас продуктамииммунорегуляторных генов (Ia-белками),премированных на плазматической мембранемакрофагов.Вкупе с медиаторамитипа интерлейкиновэто определяетцентральную позициюмононуклеарных фагоцитов в механизмахформированияприобретенногоиммунитета.Для нейтрофиловне удалосьдобиться большего,чем факта слабогоусиления пролиферации В-лимфоцитовнейтральнымипротеиназами нейтрофиловчеловека и негативного влияния избытканейтрофиловна аналогичныйфеномен. Скореевсего, это«пробирочные»реакции, неимеющие серьезногоприложенияк регуляциилимфоцитарныхфункций invivo.Иначе обстоитдело
на уровнеэффекторногозвена иммунныхпроцессов.По существу,ни одно из проявленийприобретенногоиммунитетане воспроизводитсяв полном объемебез участия моноцитов-макрофагови (или) полинуклеаров.Об этом говорят реакции, наведенныеантителами-опсонинами, гиперчувствительностьзамедленного типа, повреждения,вызываемыеиммуннымикомплексами,и проч.

Зависитот МФ ответлимфоцитовна неспецифическиемитогены —фитогемагглютинин,конканавалинА, перийодат,как и продукцияими лимфокинов— МИФ, МАФ, лимфотоксинаи др. Предполагают,что активацияТ-лимфоцитовосуществляетсянепосредственносвободным илисвязанным сМФ митогеном,а МФ выделяетфактор, трансформирующийТ-клетки. МФ,выделяя различныефакторы, регулируютпролиферациюи дифференцировкунезрелыхкостномозговыхМФ, програнулоцитов,возможно, эритроидныхклеток. Удалосьвыявить генетическиобусловленныеразличиярегулирующеговлияния МФ напролиферативнуюактивностьстволовыхкроветворныхклеток. Макрофагитакже с помощьюразличныхрастворимыхфакторовусиливаютпролиферациюфибробластов,эпидермальныхклеток кожи,эндотелиясосудов, участвуютв созреванииклеток тимуса.

Сегодняне может бытьполностьюпринята гипотезао центральнойроли тимусаи Т-клеток впротивоопухолевомнадзоре, посколькуесть сведенияоб одинаковойчастоте возникновенияопухолей убестимусныхи нормальныхживотных,одинаковомих отторженииу иммунодефи-цитныхили супрессированныхживотных,ограниченномчисле опухолейу людей с тяжелойиммуносупрессией.По мнениюисследователей,роль Т-лимфоцитовдостаточнооднозначнав отторжениивирусиндуцированныхопухолей, ноона невеликапри спонтанныхи индуцированныхканцерогенаминеоплазмах.Целый ряддоказательствсвидетельствуето сложной системеестественнойи приобретеннойантиопухолевойзащиты организмаи ограниченнойроли в нейТ-лимфоцитов.Об этом говоритраннее развитиеестественнойрезистентностик опухолям напротяжениинесколькихдней послерождения, подавлениеее при введениивеществ, угнетающихМФ, непосредственноперед трансплантациейопухоли илиодновременнос ней, совпадениеиндуцированнойстимуляциирезистентностик опухолям сактивированиемМФ. Поэтому всебольшее значениев этой системепридают МФ.Оказалось, чтонеактивированныеМФ не оказываютантиопухолевоедействие, ноположениеменяется приактивацииклеток, котораяможет бытьспецифическойи неспецифической.Специфическаяактивациявозникает уклеток, взятыхиз иммунногоорганизма илиу интактныхМФ, инкубированныхс иммуннымиТ-лимфоцитами, с этими лимфоцитамии АГ или с продуктамиреакции. МФ вэтом случаеактивируютсяспецифическимармирующимфактором,специфическиузнают и убиваютопухоль в результатецитолизиса.Неспецифическаяактивацияобусловленаинфекционнымпроцессом,эндотоксинами,липидом А,полинуклеотидами,иммуннымикомплексамииной специфичности.Активированныетаким путемМФ приобретаютцитостатическиесвойства. МФмогут армироватьсяспецифическимк данным лимфоцитамфактором инойспецифичностив отличие отфактора, индуцированногоопухолевымиАГ, в таком случаеони становятсянеспецифическицитотоксичнымипо отношениюк опухоли. Поэтому,если к иммуннымМФ добавитьспецифическиеопухолевыеклетки, а затемчерез некотороевремя неспецифические,МФ будут специфическилизироватьгомологичнуюмишень и неспецифическиподавлятьнеродственную.

Таким образом,МФ в организмескорее всегопроявляютодновременноспецифическуюи неспецифическуюклеточнуюцитотоксичность,обнаруживаяв первом случаецитолитические,а во втором —цитостатическиепотенции.

АктивированныеМФ подавляютпролиферациюнормальныхи опухолевыхсингенных,алло-генныхи ксеногенныхклеток — быстропролиферирующихсильнее, чеммедленнопролиферирующих.Однако быстропролиферирующиеопухолевыеклетки полностьюподавляются,тогда как нормальныеклетки — лишьчастично.

МеханизмцитотоксичностиМФ сложен.Специфическийармирующийфактор с молекулярноймассой 25000—50000 дальтонимеет аффинностьк АГ опухоли,связываетсяс поверхностьюМФ, секретируетсякоммитированнымиТ-лимфоцитами.Важен межклеточныйконтакт мишении МФ, которыйпостоянновозникает,причем зонаконтакта имеет100—200А. Предполагают,что он можетспособствовать локальномуслиянию иинъецированиюв мишень лизосомМФ, лизирующихее. По разным данным, киллингможет осуществлятьсясериновыми протеазами,возникающимпод влияниемлизосомальныхгидролазСЗа-субкомпонентомкомплемента,катионнымбелком илииндукцией макрофагамив мишеняхаберрантногоделения, приводящегок их лизису.Вместе с темсчитают, чтороль простагландинов,аргиназы, перекисиводорода иинтерферонане столь существеннав непосредственномцитолитическомэффекте.

Определенноезначение придаютизменениюструктурымембран эффекторови мишеней, таккак обработкаМФ фосфолипазойили лизолецитиноминдуцируетв них противоопухолевуюцитотоксичность,что объясниливозможнымобразованиемна мембранецитолитическойструктурыв результатеизменения ееконформации.Подобные процессы,по-видимому,происходятпри активацииМФ липополисахаридами(ЛПС), врезультатекоторой ЛПСчерез липидА связываетсяс плазматическоймембраной М.Ф,изменяя ееорганизациюв результатеформированиякомплексалипид А — мембранныйлипид, поэтой же причине,возможно,тумороциднаяспособностьМФ резко подавляласьпосле их экспозициис липопротеидаминизкой плотностиили холестериновымилипосомами.

В организмев силу постоянноговыделениябактериальныхэндотоксинов,иммунологическихреакций различнойспецифичности,сопровождающихсяосвобождениемлимфокинов,образованиемиммунных комплексов,постоянноподдерживаетсяпопуляциянеспецифическиактивированныхМФ, выполняющихнадзор заспонтаннопоявляющимисятрансформированнымиклетками иэлиминирующимиих.

МФ имеютогромное значениисистемы мононуклеарныхфагоцитовв естественнойустойчивостиорганизма копухолям.Посколькуподавлениепролиферациимакрофагамине зависит отвида и типаклеток, характеристикироста, трансформациии реактивности,это свидетельствуето наличии у МФструктурузнавания, неимеющих иммунологическойспецифичности.В мишенях появляютсяобщие изменения,узнаваемыевездесущимиМФ, которыепоэтому являютсяширокими регуляторамиобщего клеточногогомеостаза.

За 120 лет,прошедшие содня созданияИ. И. Мечниковымученияо фагоцитах,оно ушло далековперед. РольМФ оказаласьнеизмеримоболее широкойи вышла за рамкииммунологии.

Эта теорияоказалаглубочайшееконструктивноевлияние на всеразвитие современнойиммунологии.Именно онапослужиланачалом изученияклеточныхаспектовиммунитета.Некоторыеаспекты теории,предсказанныеИ. И. Мечниковым,до сих пор остаютсянедостаточноразработанными.Очевидно,что научноенаследие, оставляемоенам И. И.Мечниковым,и в будущембудет определятьосновные направленияучения о фагоцитах.

Макрофагиперитонеальногоэкссудата какмодель фагоцитоза и нарушений фагоцитарнойактивности.

В организмечеловекафагоцитирующуюфункцию выполняютнесколько типовклеток. Преждевсего, это теклетки, которыеосуществляютзащиту прикаких-либоинфекциях иинвазиях –макрофаги,моноциты инейтрофилы.В меньшей степениона представленау эозинофилови базофилов.Кроме того,общеизвестнымявляется тотфакт, что в различныхтканях фагоцитирующуюфункцию берутна себя (помимовездесущихмакрофагов)специфическиеклеточныеэлементы даннойткани, например:фиброкласты,остеокласты,клетки микроглии.Также нельзязабывать о том,что к тем немаловажнымклеткам, благодарякоторым идетспецифическийиммунный ответ,относятсядендритныеклетки, широкопредставленныев местах, являющихсябарьернымив организме.И хотя их фагоцитирующаяфункция доконца не доказана,данные о том,что это так,есть.

Существуютразличныеметоды изученияфагоцитирующейактивностиу клеток, перечисленныхвыше. В данномреферате будутрассмотреныметоды изучениятех фагоцитов,у которыхфагоцитирующаяфункция наиболеевыражена икоторые представляютисключительнуюважность виммунной системечеловека, а ихпатология носиттяжелый характер.Речь идет омакрофагах(МФ). Они хорошоподдаютсяизучениюinvivoи invitro,культивированию;моделированиеразличныхпроцессов наэтих клеткахполучило широкоераспространениеи дало хорошиерезультаты.Это обусловленоих крупнымиразмерами,широчайшейраспространенностьюв организме,активностьюметаболическихпроцессов,протекающихв них, разнообразиемфункций, на нихвозложенных.

В качествемодели, хорошосебя зарекомендовавшейи наиболеечасто используемойв опытах поизучению фагоцитов,можно рассмотретьмодель перитонеальныхмакрофаговinvitro.Широкоераспространениеданная модельполучила понесколькимпричинам. Во-первых,она легковоспроизводится.Во-вторых, онапозволяет легкорегистрироватьрезультатыисследований.В-третьих, даннуюмодель можнополучить каку лабораторныхживотных (крысы,мыши, морскиесвинки), так иу человека.В-четвертых,при проведенииопытов на животныхможно использоватьразличные линииживотных (вт.ч. нокаут-животных)и животных сприобретенными(искусственновызываемыми)дефектамииммунитета.В-пятых, припостановкеопытов можноиндуцироватьсептическоеи асептическоевоспаление,можно передвзятием клетокпровести различныевоздействия,а на моделилишь зарегистрироватьрезультаты(т.е. сама реакцияпроходит invivo).

Можно приводитьтакже и другиепричины, ноограничимсяэтими. Естественно,эта модель неявляетсяединственной,предложеныи другие, о которыхбудет упомянутониже.

Итак, рассмотрениевыбранноймодели будетпроисходитьследующимобразом:

Варианты получениямодели.
Возможныеметоды регистрациирезультатовисследования.
Различныевариантымоделируемыхпроцессов.

Вопросы,касающиесяпрактическогоаспекта использованиярезультатовисследования,будут рассматриватьсяв каждом случае,а не будут выноситсяв отдельныйраздел.

I.Получениемодели.

Опыты проводятна белых мышах,крысах, морскихсвинках (в редкихслучаях накроликах) различныхлиний (CC57/W,CBA,«WISTAR»,C57BL/6),а также на нелинейныхживотных.Выделяютиндуцированныеи неиндуцированныеМФ. В случае,если необходимыинтактные МФ,то животнымвводят интраперитонеально стерильный10% раствор пептонаили несколькомл стерильногопарафиновогомасла, можнотакже использовать2,5% раствор крахмалав физ. растворе.Обычно, через48 часов наркотизированноеживотное забивают,перитонеальнуюполость промываюти перитонеальнуюжидкость отсасывают.В полученнуюжидкость добавляютстабилизатор(гепарин, глютатион)и антибиотики(но только немакролидовогоряда!), чащеиспользуютпенициллин,стрептомицин.Далее жидкостьможно центрифугироватьи последующейвыдержкой, аможно сразувыдерживатьв стеклянныхкюветах (2 ч).Основной принципсостоит в том,что макрофагиобладают способностьюприкреплятьсяк стеклу илипластику, тогдакак другиеклетки этойспособностьюне обладают.После экспозициисаму средусливают (илипромывают) иготовят новую,не содержащуюгепарин. Полученнаятаким образомпопуляцияклеток считается,что состоитна 95% из МФ. Далееклетки помещаютна специальныесреды (N199)с питательнымивеществамии антибиотиками.Сохранятьсятакие МФ могутне более 48-72 часовпри поддержанииоптимальнойтемпературы(37 С) и ионно-осмотическогобаланса.

В случае, ежелинеобходимыактивированныеМФ, то их активациюпроводят путем

Иммунизацииживотноговведениемразличныхсывороток илимощных антигенов,
Индуцированиемочага септического воспалениябрюшины (введениетоксина в р-репептона, введениевзвеси убитыхили живыхмикроорганизмов).

Дальнейшиедействия совпадаютс уже названными.

Представляетинтерес такжевыделениечеловеческихМФ. Обычно, ихполучают изасцитическойжидкости больныхс недостаточностьюкровообращенияIIIстепени. Затемих осаждаютцентрифугированием(400g,10 мин), замораживаютпри температурежидкого азота. После размораживанияих помещаютв специальныечашки со средойи культивируют.

ПодчаснепосредственноМФ полученныеиз перитонеальногоэкссудатаслужат лишьдля регистрацииопыта поставленногонад животным invivoи их культивированиеносит толькодиагностическиххарактер.

II.Регистрациярезультатов

После постановкиопытов возникаетрезонный вопрос,а как обнаружитьизменениеактивностиМФ, как определитьте изменения,повлиявшиена работуфагоцитирующихклеток. В нашейстране наиболеешироко используетсянесколькометодов.

Для исследованияпоглотительнойфазы фагоцитозаиспользуютразличныетест-объекты.Ими могут служитькроме микробовэритроцитыи различныеиндифферентныечастицы: латекса,туши, кармина,коллоидногоугля, кадмия.Поглотительнуюактивностьфагоцитовоцениваютпрямым визуальнымподсчетомпоглощенныхмикробов илидругих частицвнутри МФ, атакже по числучастиц, оставшихсянепоглощенными,например частицлатекса, с помощьюэлектронногосчетчика частиц,эритроцитовпо концентрациигемоглобинаспектрофотометрически,эмульгированныхчастиц масляногокрасного соспектрометрическойрегистрациейили меченныхфлюоресцеинизотиоцианатоммикрококковс помощьюфлюориметра.Высокаяточность ипроизводительностьхарактеризуютметод изученияфагоцитозафлюоресцирующихчастиц латексас помощьюавтоматическогопроточногоцитофлюо-риметра.При использованиипрямого визуальногометода рассчитываютфагоцитарныйиндекс (ФИ) —процент фагоцитирующихклеток от общегочисла, фагоцитарноечисло (ФЧ) — среднееколичествочастиц, захваченныходной клеткой.Отдельно учитываютрезультатычерез 1 и 3 ч:соответственноФИ1, ФИ3, ФЧ1 и ФЧ3, а также коэффициентфагоцитарногочисла (КФЧ):отношение ФЧ1к ФЧ3 — показатель,характеризующийскорость фагоцитоза.

Необходимопомнить, чтоэффективностьвсех этих показателейзависит от рядаусловий, такихкак длительностьинкубации,формы дна сосуда— круглой иконической(в коническихпробиркахнаблюдалисьболее высокиепоказателифагоцитоза,что, видимо,обусловленостимулирующимвлияниемкороткодистанционноговзаимодействия),pHсреды, содержаниякислорода иуглекислоты.

Оценкахемотаксисалейкоцитовосуществляетсядвумя распространеннымиметодами. МетодБойдена основанна принципепрохождениялейкоцитовиз одной половиныкамеры со взвесьюклеток в другуюполовину схемоатрактантом,разделенныхмежду собоймембраннымфильтром. Дляизучения хемотаксиса макрофаговприменяютфильтры с размеромпор соответственно5— 8 мкм. Имеющиесяразновидностиметода Бойденавключаютдвухфильтровыйи радиоизотопныйварианты. Другойметод основанна хемотаксисепод слоем агарозы.В качествехемоатрактантачаще используютобработаннуюзимозаном илилипополисахаридомсыворотку,казеин, фильтраткультуры Е.coliили другихмикроорганизмов,синтетическиеформилпептиды.

Движениеклеток приотсутствиихемотаксическогостимула даетхарактеристику

случайной двигательнойактивности (спонтанная миграция) фагоцитов.

Измерениеэластичностиклеток такжеможно осуществитьв камерах Бойдена.

Адгезивныесвойства фагоцитовоценивают поприлипаемостина поверхностистекла

или в колонкахс бусами. Междуспособностьюк распластываниюмакрофагов,оп-

ределяемойпод фазово-контрастныммикроскопом,и фагоцитозомимеется

определеннаякорреляция

Для оценкиуровня активностиМФ используетсяполярографическийметод (потреблениекислорода),НСТ-тест(восстановлениенитросинеготетразолия),йодирование(переходрадиоактивногомеченого йодав кислотонерастворимыйосадок), окислениеглюкозы (образованиемолекул ¹⁴СО₂при окисленииглюкозы-1-¹⁴С).Данные тестыоснованы натом, что активацияМФ сопровождаетсякислородзависимымметаболическим«взрывом».Классическимиз данных методовстал НТС-тест.Дело в том, чтоактивированныефагоциты способныпоглощатьнитросинийтетразолий(НСТ) и восстанавливатьего в формазан.НСТ-тест позволяетдифференцироватьактивированныеи интактныефагоциты, ноего нельзясчитать количественным,так как визуальнаяоценка результатовсубъективна
Также дляопределениябактерициднойспособностиМФ используетсяхемолюминесцентныйметод, предложенныйсравнительнонедавно. Какизвестно, фагоцитознейтрофиламии макрофагамисопровождаетсягенерациейактивных формкислорода(О₂-,Н₂О₂,ОН^-),индуцирующихявление хемилюминесценции.Последняяпропорциональнаинтенсивностигенерациифагоцитамиактивных формкислорода иможет служитькосвеннымкритерием ихфагоцитарнойспособности,тем более чтообразуемыепродукты обладаютвыраженнымибактерициднымисвойствами.Метод анализахемилюминесценциииспользуетсяв клинике иэксперименте.

Среди методоврегистрацияхемилюминесценции(ХЛ) являетсянаиболеечувствительными информативнымметодом функциональнойоценки фагоцитирующихклеток, но вместес тем и однимиз наиболеесложных, нестолько вметодическомплане, скольков пониманииприроды биохимическихи физическихпроцессов,которые приводятк излучениюсвета. Механизмы,лежащие в основеХЛ фагоцитов,сложны и недостаточноизучены. Свечениеможет возникатьв реакцииO₂+O₁=2O₂+hV,важную рольмогут игратьрадикалы ОН-.Анализ различныхингибиторовсвечения приводитк мысли, чтосинглетныйкислород,гидроксильныйрадикал иперекись водородавовлечены впроцесс ХЛ.

ХЛ фагоцитирующихклеток значительноусиливаетсяв присутствиилюминола или

люцигенина.

Предложеномного методоврегистрацииХЛ фагоцитарныхклеток, этиметоды можноразделить на2 основных класса.

/. РегистрациясобственнойХЛ. УсилениесобственнойХЛ фагоцитирующихклеток наблюдаетсяпри стимуляцииопсонизированнымзимозаном,бактериями,частицамилатекса. СобственнаяХЛ клеток имеетнизкую интенсивностьи лежит в широкомспектральномдиапазоне смаксимумомв области 400—500нм. РегистрацияХЛ требуетвысокий чувствительностиприбора идостаточногоколичествавыделенияклеток (обычноне менее 10⁶клеток). Эритроциты,гемоглобин,сыворотка кровиингибируютХЛ.

2. ХЛ в присутствиилюминола.Свечение имеетна 2— 3 порядкабольшую интенсивность,чем собственнаяХЛ. УсилениеХЛ наблюдаетсяпри действиизимозана, бактерий,частиц латекса,комплексовантиген — антитело,ионофора кальция, хемотаксическихпептидов. ХЛможет наблюдатьсяв суспензиикак выделенных,клеток, так иклеток в сывороткекрови.

Таким образом,хемилюминесцентныйметод позволяетпроводитьбыструю количественнуюоценку фагоцитарнойи бактерициднойактивностиклеток. Он можетиспользоватьсяпри исследованиималых количествбиологическогоматериалакрови, или можетслужить какдля оценкисостоянияклеток, так идля оценкиопсоническойактивностисыворотки ивлияния лекарственныхпрепаратов.

Наиболееточными и быстрымиметодамиопределенияфагоцитарнойактивностилейкоцитовявляютсярадиометрические.Так, поглотительнуюспособностьоценивают поуровню включенияизотопа вфагоцитирующиеклетки. Дляэтого используютмеченные Сrэритроциты,радиоактивнуюмасляную эмульсиюили микробы,меченные¹⁴С-глицином,³Н-лейцином,³Н-уридином,или частицы¹⁹²Ir.Иногда фагоцитозоценивают поуменьшениюметки (³²Р)во внеклеточнойсреде.

Радиометрическиеметоды отличаютсябыстротойпостановкии объективностьюоценки результатов.Как правило,в конце инкубациимикробов сфагоцитамипоследниеразрушаютосмотическимлизисом, замораживанием— оттаиваниемили дезоксихолатомнатрия, затемдобавляют на30 мин при 37°С³Н-тимидини подсчитываютрадиоактивностьосажденныхна фильтребактерий. Спомощью двойнойметки определяютодновременнопоглотительнуюи бактерициднуюфункцию лейкоцитов.Для этогопредварительнометят микробыодним из изотопов(¹⁴С-фенилаланин,¹⁴С-ацетатнатрия), а затемв конце инкубацииразрушаютфагоциты ивносят ³Н-тимидин.Радиоактивностьпервоначальномеченых микробов,включенныхв фагоциты,будет отражатьих поглотительнуюфункцию, арадиоактивность,включеннаяв микробы, послеразрушенияфагоцитов будетхарактеризоватьих бактерицидность.Существуютавторадиографическиеметоды оценкизавершенностифагоцитозапо включениюизотопа в процессеинкубации настеклах монослояфагоцитов смикробами.

Одним изпоказателейфункциональнойактивностимакрофаговявляется уровеньактивности5’-нуклеотидазы.Активностьданного ферментаопределяютв суспензиине разрушенныхМФ по методуТуманян иКириличевой. Метод отличаетсяпростотой иточностью,достоверностью,достаточночасто используется.

III.Некоторыемоделируемыепроцессы.

СНИЖЕНИЕБАКТЕРИАЛЬНОЙАКТИВНОСТИПЕРИТОНЕАЛЬНЫХМАКРОФАГОВМЫШЕИ В УСЛОВИЯХСОЧЕТАННОГОПРИМЕНЕНИЯСТАФИЛОКОККОВОГО

ЭНТЕРОТОКСИНАТИПА А И ЭНДОТОКСИНА

Механизмыпатогенногодействиястафилококковыхэнтеротоксинов(СЭ) изученынедостаточно.Известно, чтоблокадаретикулоэндотелиальнойсистемы (РЭС)торотрастомповышаетчувствительностьживотных крвоте, индуцированнойСЭ. Это предполагает,что функциональныйстатус РЭСиграет важнуюроль в ответеорганизмана энтеротоксин.Данные литературысвидетельствуюти о возможностивлияния СЭ нафункционированиефагоцитирующихклеток. Во-первых,введение СЭобезьянам черезжелудочныйзонд приводитк развитиюострого гастроэнтеритас экссудациейнейтрофилов,макрофагови другими признакамивоспаления.Во-вторых, важнейшимсвойством СЭявляется способностьсенсибилизироватьживотных клетальномудействию эндотоксиновграмотрицательныхбактерий(липополисахарид— ЛПС), что ставитих в один рядс веществами,вызывающимигиперактивациюРЭС, и такжеоказывающимисенсибилизирующеедействие. Принимаяво вниманиепостоянныйконтакт организмас условно-патогеннымибактериями,а соответственнои с эндотоксинамикишечной микрофлоры,исследованиемакрофагальныхфункций, ответственныхза элиминациюмикроорганизмовв условияхвоздействияСЭ и при сочетаниемпримененииих с ЛПС, приобретаетособую актуальность.В связи с этим,задачей опытаявилось изучениеосновныхзакономерностейизмененияфагоцитарнойи бактерициднойфункций макрофаговпод действиемСЭ типа А (СЭА)и ЛПС.

Iсерию опытовпо изучениюфагоцитарнойи бактерициднойактивностипроводили смакрофагами,полученнымиот мышей следующихгрупп: 1-я — через2 ч после инъекцииэнтеротоксина,2-я и 3-я — через24 ч после введенияСЭА и ЛПС вотдельности,4-я — через 24 чпосле введенияэндотоксинана фоне СЭА.СЭА вызывалдвукратноеснижение общегочисла клетокуже через 2 чпосле инъекции;через24 ч общее количествоклеток по-прежнемуоставалосьпониженным.Если ЛПС у интактныхмышей способствовалувеличениювыхода клетокв брюшную полость,то на фоне СЭАих количествоне только невозрасталопод действиемЛПС, а дажедостоверноуменьшалосьпо сравнениюс контролем.

Изучениефагоцитарнойи бактерициднойактивностимакрофаговчерез 2 ч послевведения мышамСЭА выявилоих заметноеснижение посравнению споказателямидля контрольныхживотных. Через24 ч после инъекцииСЭА и ЛПС вотдельностинаблюдалосьусилениефагоцитоза.Выявленныезакономерностиизмененияфагоцитарнойфункции макрофаговвполне согласуютсяс даннымилитературы,посвященнымиизучению клиренсаугля у кроликовпосле введениястафилококковыхзнтеротоксинов.Н. Sugiyamaтакже наблюдалбифазовыеизмененияфагоцитарнойфункции РЭС;подавлениестепени клиренсаугля через 2чпосле инъекции,сменяющеесяего увеличениемчерез сутки.

Бактерициднаяактивностьмакрофагов,полученныхчерез 24 ч послеобработкиживотных отдельноСЭА и ЛПС, такжевозрастала.В случае жесовместноговведения указанныхтоксинов функцияпоглощенияизменяласьнезначительно,зато степеньзавершенностифагоцитозарезко снижалась.Необходимоотметить, чтоисследованиеморфологическогосостава клетокперитонеальногоэкссудата мышейчерез 24 ч послеинъекции СЭАи ЛПС не выявилосущественныхразличий впроцентномсоотношениимакрофаговв опытных группахживотных.Поэтому можноутверждать,что выявленныеизмененияфагоцитарнойи бактерициднойфункций обусловленывлиянием исследуемыхтоксинов.

Для уточненияхарактеравлияния СЭАи ЛПС на функциональнуюактивностьмакрофаговследующую сериюопытов провелив системе invitro.С этой цельюрезидентныеперитоне-альныемакрофаги,полученныеот интактныхживотных,инкубировалис токсинамив течение 24 ч.В данном случаефункция поглощенияизменяласьв меньшей степени.Бактерициднаяактивность,также как и вопытах invivo,повышаласьпод действиемСЭА и ЛПС вотдельности.При одновременномдобавлениитоксинов кмакрофагамбактерициднаяфункция увеличивалась,а в условиях,приближающихсяк таковым invivo,т. е. при добавленииЛПС через 4 чпосле СЭА,способностьмакрофаговубивать Staph.aureusтакже резкоснижалась.

Таким образом,в условияхсочетанногопримененияСЭА и ЛПС происходитрезкое снижениефункции завершенногофагоцитозамакрофагов.Тот факт, чтов условиях invitroпрослеживаютсяте же закономерности,что и в системеinvivo,предполагает,что СЭ оказываетнепосредственноедействие намакрофагальныефункции. Учитывая,что фагоцитирующиеклетки представляютсобой первуюлинию защитыот чрезвычайнораспространенныхусловно-патогенныхмикробов, снижениебактерицидныхсвойств в условияхсинергическогодействия СЭс эндотоксинамиграмотрицательныхбактерий ворганизме можетпривести кразвитию тяжелыхсептическихосложнений.

ОТМЕНАУСИЛИВАЮЩЕГОФАГОЦИТОЗДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВС ПОМОЩЬЮ

ФРАГМЕНТОВАНТИТЕЛ ПРОТИВFc-РЕЦЕПТОРОВМАКРОФАГОВ

Один изнаиболее важныхи давно установленныхиммунологическихфеноменов —усиление захватафагоцитирующимиклеткамикорпускулярныхантигенов послеих сенсибилизацииIgG-антителами— оставалсяпродолжительноевремя малоизученным.После выясненияпринциповструктурнойорганизациимолекулы IgGи обнаруженияна поверхностифагоцитов ив том числемакрофаговрецепторовдля Fc-участкаIgG было постулировано,что опсонизирующиеантитела обеспечиваютусиление захватакорпускулярногоантигена благодарявзаимодействиюFc-участкамолекулы антителас Fc-рецептором(FcR)макрофага.Единственнымэкспериментальнымдоказательствомв пользу этогобыл факт отсутствияу Fab-фрагментовопсонизирующихантител способностиусиливатьзахват корпускулярногоантигенадоказательствавовлеченияFcRв процесс захватаопсонизированногокорпускулярногоантигена. Подобныйэкспериментальныйподход нельзярассматриватькак адекватныйдля прямогодоказательствавовлеченияFcRв процесс захватаопсонизированногокорпускулярногоантигена. Исходяиз сказанного,было решенополучить прямыедоказательствароли FcRв реализациимеханизмаусиления захватамакрофагамикорпускулярногоантигена,сенсибилизированногоIgG-антителами.Это было достигнутопри оценкевлияния науказанныйпроцесс Fab-фрагментовантител противFcRмакрофагов,которые, какбыло установлено,препятствуютвзаимодействиюс макрофагамиагрегированногоIgG.Пре-инкубацияперитонеальныхмакрофаговс Fab-фрагментамианти-FcR-антителполностьюотменяла эффектусиления захватамакрофагамиопсонизированногоантигена.

В результатеопыта былоустановлено,что Fab-фрагментIgGиз анти-FcR-сывороткиэффективноблокирует FcRмышиных макрофагов,препятствуясвязываниюэтими клеткамигетерологичного агрегированного IgG.Эти данныехорошо согласуютсяс фактом блокирования FcR перитонеальных макрофагов бивалентными FаЬ-фрагментами из антиFcR.Эти данные всочетании срезультатамиконтрольныхэкспериментов,свидетельствующимиоб отсутствииспособностиблокироватьFcRFab-фрагментамиIgGиз антисывороткипротив иммунногопреципитата,указывают навозможностьиспользования моновалентныхFab-фраг-ментовaнти-FcR-aнтитeл дляизучения функцииFcRмакрофаговв реализациидействия опсонинов. Следует подчеркнуть, что использованиемоновалентных фрагментов анти-FcR-антителимеет принципиальное значение приизучениифункциональнойроли FcR,поскольку вотличие отнерасщепленных антител или бивалентныхFаЬ-фрагментовмоновалентныеFab-фрагментынеспособны,связавшисьс FcR,вызвать при37 °С их латеральноеперемещениепо цитоплазматическоймембране ипоследующий кэппинг.

Полученныеданные свидетельствуют,что преинкубациямакрофаговс Fab-фрагментамиaнти-FcR-антителполностьюотменяет эффектусиления фагоцитозаS.typhimurium(взятуюкак объектпроверкиэффективностифагоцитоза),обусловленныйIgG-антителамикролика противэтого микроорганизма.СобственноFab-фрагментыaнти-FcR-антителне оказываюткакого-либовлияния нафагоцитознесенсибилизированныхантителамибактерий. Еслик макрофагампредварительнодобавлялиFab-фрагментыантител кроликапротив иммунногопреципитата,образованногояичным альбуминоми IgG-антителамикролика противэтого антигена,это не оказывалоникакого влиянияна процессфагоцитозасенсибилизированныхантителамибактериальныхклеток.

Таким образом,Fab-фрагментыанти-FcR-aнтителизбирательноподавляютфагоцитозтолько сенсибилизированныхантителамибактерий. Сучетом результатовконтрольныхэкспериментовэто служитнесомненнымдоказательствомв пользу того,что усилениезахвата корпускулярногоантигена послеего опсонизацииIgG-антителамиобусловленновзаимодействиемFc-уча-сткаопсонизирующихантител с FcRмакрофагов.

Обращаетна себя вниманиетот факт, чтомакрофаги,предварительнообработанныеFab-фрагментамиaнти-FcR-антител,менее эффективнопоглощаютсенсибилизированныеантителамибактериальныеклетки, чемнесенсибилизированные.Этот результатможно объяснить,исходя изпредставления,что послесенсибилизациибактерий участи из нихпроисходитстерическоеэкранированиеучастка клеточнойповерхности,посредствомкоторогомикроорганизмыприкрепляютсяк макрофагам.Фагоцитозтаких бактериальныхклеток осуществляется,по-видимому,после взаимодействиядвух молекулантител илиболее черезих Fс-участкис несколькимиFcRна цитоплазматическоймембранемакрофага. Еслиуказанноепредположениесправедливо,захват этойчасти сенсибилизированныхбактериальныхклеток будетневозможенпосле блокированияFcRс помощьюFab-фрагментовaнти-FcR-антител.

Полученныев настоящейработе данныеоткрываютновые подходыдля регуляциипроцессаиммунногофагоцитоза,что может иметьсущественноезначение длядетальногоанализа ролиэтого процессапри различныхпатологическихсостояниях.

УСИЛЕНИЕС ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНАРЕАКЦИИ КОНТАКТНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯМАКРОФАГА СТИМОЦИТАМИ invitro

Старая имногограннаяпроблемаиммуностимуляцииприобрела новоевыражение всвязи с поискомпутей к созданиюискусственныхвакцин. Основныеусилия в данномнаправлениисвязаны с получениемконъюгатоввакцинирующихантигенныхдетерминантс природнымиили искусственносинтезированнымиполимерныминосителями.Роль носителяв таком молекулярномкомплекседолжна состоятьв усиленииспецифическогоответа на избраннуюантигеннуюдетерминанту.

При поискеэффективногоносителя, которыймог бы бытьиспользованпри конъюгациис антигеном,необходимоиметь сведенияо его адъювантномэффекте и отсутствиипобочныхпатогенетическихсвойств. В этойсвязи былообращено вниманиена хитозан —гомополисахарид,выделяемыйиз хитина наружногоскелета беспозвоночных.Молекулярнаямасса изучаемоговещества ~120000 дальтон.

Цель исследования— выяснитьвлияние хитозанана процессконтактноговзаимодействиямакрофага стимоцитамив опытах invitro.Обращениек данным клеточнымтипам не случайно.Известно, чтовзаимодействиемакрофага стимоцитамиявляетсядополнительнымфакторомтрансформациинедифференцированныхтимусзависимыхклеток в зрелыеТ-лимфоциты.В связи с этиминтересноопределить,оказывает ликакое-либовлияние избранныйгомополимерна один из самыхранних этаповстановленияиммунной системы— формированиефункциональноактивной популяциизрелых Т-клеток.

Было проведено3 серии опытов.В 1-й серии изучалихарактервзаимодействиясингенныхтимоцитов сприлипающимиклеткамиперитонеальногоэкссудата,которые инкубировалинепосредственноперед постановкойреакции с однойиз выбранныхдоз хитозанав течение различноговремени. Установлено,что наиболееэффективнореакция гроздеобразованияпроходит при30-минутнойинкубациимакрофаговс хитозаном.Количествотимоцитов,группирующихсявокруг макрофага,в 2,5 раза большепо сравнениюс таковым вконтроле. Вэтой же серииопытов решалсявопрос обинтенсивностивзаимодействияанализируемыхтипов клетокв зависимостиот дозы, использованногодля инкубациихитозана, приоптимальномвремени инкубации30 мин. Выяснено,что наибольшееусиление реакциигроздеобразованиянаблюдаетсяпри добавлениив культуру 50мкг полисахарида.

Во 2-й серииопытов анализреакции гроздеобразованияпроведен вусловияхпредварительной30- и 60-минутнойинкубациитимоцитов сразными дозамихитозана. Инкубацияв течение как30, так и 60 мин приводилак усилениюконтактноговзаимодействиятимоцитов смакрофагами.Как и в предыдущейсерии опытов,оптимальнаядоза, усиливавшаяэффект гроздеобразования,равнялась50 мкг.

В заключительной3-й серии опытовпроведеноизучениеинтенсивностигроздеобразованияпри внесениихитозананепосредственнов реагирующуюсистему макрофаг—лимфоцит.Как и в 2 предыдущихсериях опытов,констатированоусиление контактноговзаимодействиятимоцитовс макрофагами.

Для объяснениявыявленныхфактов необходимоиметь в виду,что хитозанявляетсяполикатионом.В то же времяинтегральныйзаряд как тимоцитов,так и макрофаговотрицательный.Возможно, эффектусиления контактноговзаимодействиясвязан сэлектростатическимимежклеточнымипритяжениямипод влияниемхитозана, включающими2 этапа: 1-й этап— ад-гезияположительнозаряженногохитозана намакрофаге илитимоците, 2-й —непосредственноевзаимодействиеотрицательнозаряженнойклетки склеткой-партнером,проинкубированнойс поликатиономи несущей врезультатеэтого большийположительныйзаряд. Подобноепредставлениеподкрепляетсятем, что эффектусиления реакциигроздеобразованияне связан сосхемой инкубациии будет одинаковнезависимоот того, какойтип клетокподвергалсяинкубациис хитозаном.

Второймомент, которыйтребует объяснения,— это незначительноевремя инкубацииклеток с хитозаном,при которомобнаруживаетсяэффект усиленияконтактноговзаимодействия.Возможно, чтоотсутствиеэффекта приболее длительнойинкубациисвязано с фагоцитозомвысокомолекулярногополисахарида,вследствиечего происходитвосстановлениеисходногозаряда взаимодействующихклеток. Однакопредставленноеобъяснениедолжно бытьподтвержденодополнительнымиэкспериментальнымфактами.

АКТИВАЦИЯФАГОЦИТАРНЫХКЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГОИММУНИТЕТА

СИНТЕТИЧЕСКИМИПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

Ряд перспективныхнеприродныхполиэлектролитов,использующихсядля созданиясинтетическихвакцин, обладаетмногими иммуномоделирующимипотенциями:они усиливаютмиграцию стволовыхклеток, Т- иВ-лимфоцитов,являютсястимуляторамиТ- и В-клеток,замещают хелпернуюфункцию Т-лимфоцитови макрофагов.Эти свойстваобеспечиваютсильное стимулирующеедействие нареакции гуморальногои клеточногоиммунитета.

Вместе стем недостаточноясным остаетсявопрос об ихдействии насистему фагоцитарныхклеток, формированиеклеточного,в частноститрансплантационного,иммунитета.Целью настоящейработы былоизучение этихвопросов.

Методикаисследованийбыла следующей:мышам гибридам(CBAXC57BL/6)внутрибрюшинновводили различныедозы полиэлектролитоводнократно,выделяли МФчерез 48 ч и анализировалиих.

ВведениеполианионаNA-5вызывает вмакрофагахмышей активациюгликолиза.Например, в 3экспериментахусиление гликолизапо сравнениюс контрольнымиклетками былов 1,45, 2,35, 4,3 раза. Этоочень сильнаяактивациягликолизав клетках,свидетельствующаяо переходе ихна более высокийфизиологическийуровень метаболизма.Значительновозрасталав клетках иинтенсивностьгексозомонофосфатногошунта: в 2 из 3опытов введениеполианионасопровождалосьпоявлениеммакрофаговсо среднейактивностьюокисленияглюкозы, соответствующей8,67+1,47 и 7,24+1,95 МФЕ на 10^бклеток (в контроле5,17+0,95 и 4,1 + 1,29 МФЕ на 10⁶клеток). Ещеболее сильнойоказаласьинтенсификацияцикла мочевины,различия которогопо сравнениюс контрольнымиклетками былиуже порядковыми.Например, вопытах 1—3 онисоставлялисоответственно8,43, 11,54 и 2,06 раза.

Существенноеусиление гликолизаобусловливалосьтакже введениемживотным карбоцепногополиамина Н-З:в 2 из 3 опытовактивация былазначительной,для ЛДГ онасоставлялав опытных макрофагахсоответственно89,27+7,41 и 39,54±4,56 МФЕ на10⁶клеток, в контрольных— 26,36+8,36 и 20,59+3,86 МФЕ на10⁶клеток. Стольже выраженнымбыло усилениеактивностиокисленияглюкозы, котороепревышало егов опытных макрофагахв сравнениис контрольнымив 3 экспериментахсоответственнов 2,11, 1,28 и 1,41 раза.

Крайнезначительнойбыла интенсификацияцикла мочевины,так как активацияключевогофермента АРГвозрасталав различныхопытах в 3,65—54,6раза..

В то же времяактивностьполикатионаD_11-100эбылазначительноменее выражена,он не влиялсущественнона состояниегликолиза игексозомонофосфатногошунта макрофагов.Однако все жеактивностьцикла мочевиныв клетках достоверноувеличивалась,хотя и менеесущественно,чем под влияниемН-3 и NA-5.

В макрофагахмышей, стимулированныхполианиономNA-5,почти двукратноповышаласьактивностьлизосомальныхгидролаз, составляяв опыте 27,42+4,09 нМР/ч на 10^бклеток и в контроле15,04+3,66 нМ P/чна 10^бклеток. АктивностьКФ после введениямышам Н-3 былаеще большей— 35,51+4,82 нМ P/чна 10^бклеток. Подобноеусилениесвидетельствуето существенномвозрастаниив макрофагахпереваривающейспособности.

У макрофаговмышей полианионNA-5вызывал нетолько интенсификациюнекоторых путейметаболизма,но и повышениеэкспрессиирецепторовк IgG,которое былонерезко выраженным,но статистическидостоверным.

Дозозависимымоказался ответклетки, выявляемыйпо генерациикислородныхрадикалов умышей, которымвводили различныедозы полиаминаН-3. Так, если доза0,5 мг/мышь подавлялахемилюминесценциюмакрофаговпри фагоцитозе,не изменяя еепри адгезииклеток на стекло,то дозы 1, 5 и 10 мг/мышьуже обусловливалисущественноевозрастаниехемилю-минесценциипри фагоцитозечастиц. Приадгезии этидозы такжеоказалисьактивирующими,за исключениемдозы 5 мг/мышь.Оптимальноеусиление генерацииактивных кислородныхрадикаловвызывало введениеживотным 1 мг/мышьпрепарата Н-3— в этом случаеповышаласьхемилюминесценциямаксимальнои при фагоцитозе,и при адгезии.Дальнейшееувеличениедозы не сопровождалосьповышениемдействия наклетки. Подобноенаблюдениеполностьюподтверждаетсяданными литературыо влиянии этогопрепарата наразличныеиммунологическиепараметры.

Таким образом,синтетическиеполиэлектролиты—полианионNA-5и карбоцепныйполиамин Н-3вызывают активациюмакрофагов,усиливая гликолиз,гексозомонофосфатныйшунт, цикл мочевины,активностьлизосомальныхгидролаз. Препаратыповышают такжеэкспрессиюна плазматическоймембране макрофаговFc_v-peцепторов.Имеются, однако,особенности,состоящиев том, что еслиН-3 вызываетусиление генерациимакрофагамиактивных кислородныхрадикалов,полианион NA-5оказываетсяв этом отношениинеактивным.ПоликатионD_11-100эоказываетменее выраженноевлияние намакрофаги,однако существенноповышает наних экс-прессиюРс₇-рецепторов,интенсифицируетцикл мочевины.

Формированиетрансплантационногоиммунитетаизучали у животных,которые получалиоднократновнутрибрюшиннопо 1 мг/мышьпрепаратовв день трансплантациикожи.

Результатысвидетельствовали,что все 3 препаратавызывали усилениетрансплантационногоиммунитета,выражающеесяв достоверномускоренииотторжениятрансплантатау мышей, которымих вводили.Причем, как ина других моделях,в частностипри анализесостояниямакрофаговв условияхвоздействияпрепаратов,активностьполииона D_11-100эуступала активностиNA-5и Н-3. Можно сделатьвывод, что полиионNA-5и карбоцепныйполиамин Н3обладают способностьюусиливатьклеточныйТ-опосредованныйиммунитет,менее активнымбыл D_11-100э.

АКТИВАЦИЯМАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИЕМСИНТЕТИЧЕСКОГОАНТИОКСИДАНТА

Сейчасобщепринятойсчитается закономерность:активациямакрофагов(МФ) сопряженас метаболическим(окислительным)взрывом, с активациейглюкозомонофосфатногошунта (ГМФШ), спродукциейи секрециейвысокоактивныхнестабильныхпродуктоввосстановлениякислорода —супероксиданионовО₂~,перекиси водорода(Н₂О₂),радикалов ОН~и синглетногокислорода (О₂).

Образующийсяпри этом избытоктоксичныхсупероксидныхрадикалов, атакже липопереки-си,накапливающиесяв фагосомахМФ в процессефагоцитоза,могут обусловливатьокислительноеповреждениеклеточныхмембран и связанноес этим подавлениефункций МФ. УМФ описанасобственнаясистема антиоксидантнойзащиты, включающаясупероксиддисмутазу,удаляющуюизбыток супероксидныхрадикалов, атакже глу-татионпероксидазуи НАДФ-зависимуюглутатионредуктазу,нейтрализующиелипоперекиси.

Однако принедостаточностиэндогенныхантиоксидантовмогут возникатьразличныенарушенияфункций МФ. Было показано,что алкилзамещенныепроизводные3-оксипиридина(8 ОП), оказывающиеумеренноеантиокислительноедействие, являютсяэффективнымиингибиторамисвободнорадикальныхреакций и могутбыть использованыдля защиты отдеструктивноговлияния свободныхрадикалов.

Целью работыбыло изучениевлияния синтетическихантиоксидантовна функции МФ.Из ряда синтетическихпроизводныхОП были выбраны2-третбутил-З-оксипиридин(ТБОП), у которогобыла описанаспособностьстабилизироватьмембраны эритроцитов.Исследованиепроводилисьв сравнениисо стандартнымактиваторомМФ — бактериальнымлипополисахарида(ЛПС из Е. coliО55).

Данные,полученныепри изучениинепосредственноговлияния ТБОПв сопоставлениис ЛПС на перитонеальныеМФ таковы: дляактивацииГФДГ достаточнополучасовойинкубацииклеток с ТБОП.Судя по показателямприроста активностифермента, эффектТБОП аналогичендействию стандартногоактиватора— бактериальногоЛПС. Доля распластанныхМФ возрастаетпо сравнениюс контролемуже через 2 чинкубации сиспытуемымипрепаратами.На ранних сроках(2 ч) эффект ТБОПболее выраженпо сравнениюс эффектомстандартногоактиватора— ЛПС. На болеепоздних срокахкультивирования(24 ч), активирующийэффект ЛПСпродолжаетнарастать, вто же времядоля распластанныхМФ под влияниемТБОП имееттенденцию кпонижению посравнению сранними сроками,но остаетсядостоверноповышеннойв сопоставлениис постепенновозрастающимконтрольнымуровнем.

Послевнутрибрюшинноговведения ТБОПуже через 1 чон вызываетотчетливоеповышениеколичестваклеток в брюшнойполости за счетМФ с преимущественнымнакоплениемкрупных МФ,причем и этотэффект аналогичендействию ЛПС.

МФ, извлеченныеиз брюшнойполости мышейчерез 1 ч послевнутрибрюшинноговведения ТБОП,отличалисьусиленнымраспластываниемпо сравнениюс МФ контрольныхживотных.Фагоцитарнаяактивностьэтих же МФ былаповышенной,судя по интенсивностизахвата имиклеток Candidaalbicans.В этих условияхэкспериментаТБОП по сравнениюсо стандартнымактиватором— бактериальнымЛПС — в большейстепени активируетраспластывание,а фагоцитарнуюактивностьповышает вменьшей степени.В более поздниесроки послевведения исследуемогопрепарата (1.5—24 ч) дальнейшегонарастанияколичестваМФ в брюшнойполости и ихфункциональнойактивностине наблюдали.В отличие отэтого послевведения ЛПСколичествоМФ в брюшнойполости и ихфункциональнаяактивностьдостигалимаксимальногоуровня лишьчерез 24 ч.

В связи свыявленнымивременнымиразличиямистимулирующихэффектов приизучении влиянияпрепаратовна интенсивностьочищения брюшнойполости мышейот введенныхбактерий S.typhimurium(клиренс) ЛПСвводили за 24ч, а ТБОП — за1 ч до заражения.Для оценкиклиренса вычислялисредние разностилогарифмовконцентрациибактерий через1 ч после зараженияу мышей контрольныхи опытных групп.Было обнаруженозначительноеотставаниеинтенсивностиклиренса умышей, получившихза 4 сут до зараженияпо 1 мл среды стиогликолятом,по сравнениюс контролем.

На рисункевидно, что ниТБОП, ни стандартныйактиватор МФбактериальныйЛПС не влияютна интенсивностьочищения брюшнойполости отвведенныхбактерий. Однакона фоне дефектабактерицидностиМФ, индуцированногопредварительнымвведением средыс тиогликолятом,оба препаратав равной степенидостоверноповышают исходносниженнуюинтенсивностьочищения брюшнойполости мышей.Под влияниемТБОП, как и подвлияниембактериальногоЛПС, наблюдалинормализациюуровня очищениябрюшной полости,т. е. коррекциюмоделированногов экспериментедефекта бактерицидностиМФ.

Таким образом,у изученногосинтетическогоантиоксидантаТБОП выявленаспособностьактивироватьмышиные перитонеальныеМФ при непосредственномвоздействииinvitro.После внутрибрюшинноговведения тогоже препаратанаблюдалиповышениеколичестваМФ в брюшнойполости и ихфункциональнойактивности.У мышей с предварительноиндуцированнымдефектом функцииклиренса брюшнойполости препаратспособствовалвосстановлениюнормальногоуровня антибактериальнойзащиты. По всемизученнымтестам активирующегодействия наМФ синтетическийантиоксидантне уступалстандартномуактиваторуМФ — бактериальномуЛПС. При введениимышам ТБОПнаблюдали болееранние проявленияактивации МФпо сравнениюс эффектамиЛПС.

Показателиочищения брюшнойполости мышейот введенныхбактерий послеинъекции испытуемыхпрепаратов.

Пооси ординат— средние величиныразностейлогарифмовконцентрациибактерий вбрюшной полости(М±т).I—доверительныйинтервал дляконтрольныхмышей; // — доверительныйинтервалдля мышей через4 сут после введениясреды с тиоглико-латом.а— через1 ч после введенияТБОП; б— через1 ч после введенияТБОП на фоневведения средыс тиогликолатом;в— через24 ч после введенияЛПС; г— через24 ч после введенияЛПС на фоневведения средыс тиогликолатом.

ФАГОЦИТАРНАЯАКТИВНОСТЬМАКРОФАГОВПЕРИТОНЕАЛЬНОГОЭКССУДАТА

МЫШЕЙПРИ ДЕЙСТВИИПРЕПАРАТОВПЛАТИНЫ

Макрофагиспособны вызыватьлизис различныхтипов опухолевыхклеток, не повреждаянормальныеклетки тогоже гистогенеза.Нормальные«неармированные»,неактивированныемакрофагиосуществляютвзаимодействиес опухолевымиклетками настадии ихвозникновенияи в период начальнойстадии их развития.Вещества-цитостатики,применяемыев химиотерапииновообразований,оказываютвлияние наиммунную системумакроорганизма,в частности,поражая и системумононуклеаров.Влияние различныхклассов цитостатиковна функционированиемакрофагальногозвена иммунитетадостаточноглубоко изучено.Однако данныхо характеревлияния новогокласса противоопухолевыхсоединений— координационныхсоединенийплатины намакрофаги вдоступнойлитературене встречается.Было проведеноисследование— определениедействия препаратовплатины нафагоцитарнуюактивностьмакрофаговперитонеальногоэкссудата. Вкачестве препаратовбыли взятыОксоплатина(цисдихлородиаминтрансдигидроксоплатинаIVпроизводствафирмы «Lachema»)и циклоплатам(аминциклопептиламин-5-малатоплатина(II)отечественногопроизводства).

В ходепроведенныхисследованийбыло установлено,что привнесениипрепаратовплатины непосредственнов пробирки длясчета при регистрациихемилюминесценциив опытах invitroпроисходитнезначительноеувеличениевысвобождениягидроксильногорадикала (ОН~),супероксиданиона(О^2-),синглетногокислорода('0₂),перекиси водорода(H₂0₂),что косвеннопозволяетсудить о стимуляциифагоцитарнойактивностиперитонеальныхмакрофаговпрепаратамиплатины invitro.Так, для циклоплатамамаксимальноеувеличениеобразованияактивных метаболитовкислороданаблюдалосьв дозе, равной0.5 МПД (LD=23мг/кг), и индексхемилюминесценциисоставлял 3,2по сравнениюс 2,28 в контроле,тогда как добавлениеоксоплатиныв дозе, равной¹/4МПД, ксуспензииперитонеальныхмакрофаговвызывало увеличениеиндекса хемилюменисценциис 1,69 в контрольныхпробах до 2,62 вопыте.

Неоднозначныеи достаточнопротиворечивыерезультатыбыли получены при дальнейшемисследованиивлияния оксоплатиныи циклоплатамана фагоцитарнуюфункцию перитонеальныхмакрофаговinvivo(при введениипрепаратоввнутрибрюшинномышам). Введениеоксоплатиныи циклоплатаманеиммунныммышам вызывалоподавлениефагоцитоза(на 1-й день послевведения циклоплатамаво всех дозах,на 1-й и 2-й днипосле введенияоксоплатиныво всех дозах,с установлениемстимулирующеговлияния впоследующиедни для обоихпрепаратов).

Однаковведение оксоплатиныи циклоплатамав тех же дозахв аналогичныесроки совместнос антигеннойстимуляциейдало противоположныйэффект. На 1-йдень послевведения обапрепаратавызвали дозозависимоеувеличениеиндекса хемилюминесценциина 2 и более порядка(индекс хемилюминесценцииИ_хлдля оксоплатиныв дозе 1,0 МПДсоставил 106,9, дляциклоплатамав дозе 1,0 МПД —407,0, тогда как вконтроле —1,3—2,5). В последующиедни после введенияпрепаратовиммунным мышамстимулирующеевлияние нафагоцитарнуюактивностьперитонеальныхмакрофаговпрослеживалосьотчетливо длявсех доз, ноносило менеевыраженныйхарактер.

Предполагается,что при объясненииподобногоявления нельзяоставить безвнимания фактгетерогенностиперитонеальныхмакрофагови неизбежнойреакции навнутрибрюшинноевведениеаллоантигена,выражающейсяв перераспределениисубпопуляцийперитонеальныхмакрофаговв пользу такназываемыхвоспалительныхв отличие отрезидентных.Не исключенопоявлениенезрелых резидентныхмакрофагов,также характеризующихсябольшей пероксидазнойактивностью.

Однаковозможно, чтопри подобнойпостановкереакции регистрировалсяфакт захватаи поглощенияперитонеальнымимакрофагамичастиц, коимимогли быть (иявно были) нетолько гранулызимозана, нои гетерологичныеэритроцитыбарана. В пользуэтого говорятданные работы,проделаннойX.М. Исиной влабораторииИ. Я. Учителя ,о том, что именнов 1-е сутки послеиммунизациипроисходятмаксимальныйзахват, поглощениеи разрушениемакрофагамигетерологичныхэритроцитовс последующей(к 48-му часу)стабилизациейпроцесса.Поэтому делаетсявывод, что 1-есутки введенияне могут рассматриватьсякак основополагающиепри утверждениистимулирующеговлияния оксоплатиныи циклоплатамана фагоцитарнуюактивностьперитонеальныхмакрофагов,тогда как результатыпоследующихдней являютсядостовернымподтверждениемподобногоявления

ИЗУЧЕНИЕФАГОЦИТАРНОЙАКТИВНОСТИПЕРИТОНЕАЛЬНЫХМАКРОФАГОВВ

ОТНОШЕНИИYERSINIAPESTISС ДЕФЕКТНЫМИИ ПОЛНОЦЕННЫМИ

FRA-ГЕНАМИ

Известно,что возможностьразвития чумнойинфекции вомногом определяетсяисходом взаимодействияклеток возбудителяY.pestisс фагоцитами,который зависитот степенибактерициднойактивностимакрофагов(МФ) и наличияантифагоцитарныхфакторов умикробов. КантифагоцитарнымсубстанциямY.pestisотносят термоиндуцируемыйкапсульныйантиген «фракцияI»,антигенывирулентностиV,W,Iи др.. Не исключеносуществованиенеидентифицированныхкомпонентовс той же функцией.Действие фракцииIсвязывают сингибициейбактерициднойактивностиМФ, ее участиев процессезахвата бактерийМФ отрицается.Специфическаяиммунизацияживотных приводитк изменениюМФ, котороеспособствуетускорениюпоглощениявирулентныхи вакцинныхштаммов Y.pestisи последующегоих лизиса. Впоследние годыустановлено,что детерминантыфракции Iи VW-антигеновлокализованына плазмидах,которые, вполневероятно, несути другую генетическуюинформацию,пока неидентифицированную,но, возможно,связанную сантифагоцитарнойактивностьюY.pestis.Имеющиеся влитературеданные о фагоцитозепри чуме полученыв опытах, в которыхне идентифицировалось,связано линарушениесинтеза исследуемыхантигеновс дефектомотдельныхконкретныхгенов илиутратой соответствующейплазмиды целиком.Последнеесобытие можетвызвать одновременнодефектностьпо другим, ещене исследованнымантигенам.Это еще требуетуточнения.

Цель работы— определениевклада фракцииIв процессвзаимодействиявозбудителячумы с индуцированнымиМФ иммунизированныхи интактныхэкспериментальныхживотных.

В опытахиспользовалиприродныйвирулентныйштамм Y.pestis4 (Fra⁺)и изогенныйштамм 4 (Fra-),у которогосинтез фракцииIбыл «выключен»встройкойэлемента Tn10в соответствующийген плазмиды. Испытывалипо 3 клона каждогоштамма. Бактерииперед опытомвыращивалив течение 48 чпри 28 и 37 °С на агареLB(«Difco»)рН 7,2. Фагоцитозизучали invitro в культуреиндуцированныхперитонеальныхМФ морскихсвинок и белыхмышей, интактныхи иммунизированныхподкожно однократнов дозе 10⁶микробныхклеток (МК) чумнойвакциной. Вопытах с фагоцитаминагрузка составляла50 микробныхклеток (мк) наМФ. Пробы инкубировалипри 37 °С в течение6 ч. Интенсивностьфагоцитозаоценивали спомощью показателяактивностифагоцитов(АФ) и индексазавершенностифагоцитоза(ИЗФ).

Все изученныебактерии,выращенныепри 28 °С (28°-культуры),когда синтезфракции Iнаходитсяна очень низкомуровне, поглощалисьодинаково внезависимостиот способностиих fra-геновнормальнофункционироватьи от того, выделеныиспытываемыеМФ от иммунизированныхили интактныхживотных. Вопытах с бактериями,выращеннымипри 37 °С (37°-культуры),эффективностьзахвата (АФ) вовсех пробахбыла значительнониже, чем при28 °С.. Посколькуснижение наблюдалиу штаммов какспособных, таки неспособныхпродуцироватьфракцию I,сделано предположение,что в 37°-культуреимеет местоиндукция синтезаили проявлениефункций нефракции I,а каких-тодополнительныхкомпонентовклеточнойстенки бактерий,мешающихустановлениюконтакта бактерийи МФ. Необходимадальнейшаяработа поидентификацииэтих компонентов.

МФ интактныхбелых мышейодинаковозахватывалибактерии Fra⁺-и Fra-,МФ иммунизированныхмышей несколькоактивнее поглощалиFra⁺-бактерии.МФ морскихсвинок независимоот того, полученыони от интактныхили иммунизированныхживотных, болееактивно захватывалиFra⁺-бактерии.Похоже, что ворганизмеморских свинокв отношениииспытанныхМФ фракция Iпроявляет себякак неспецифическийстимуляторфагоцитоза,тогда как в МФбелых мышейдолжна произойтиспецифическаяперестройка,сопровождающаяиммунизацию,прежде чемфракция Iокажется способнойслабо стимулироватьзахват бактерийвозбудителя.Более высокиезначения АФу вакцинированныхморских свинокв отношениикак Fra⁺-,так и Fra^--культурвозбудителячумы, выращенныхпри 37 °С, позволяютдумать такжео появленииу бактерий приэтой температурекультивированиядополнительныхфакторов, которыеобладаютизбирательнойактивностьюименно в отношенииМФ морскихсвинок. Ещеболее выраженныйстимулирующийэффект этихдополнительныхфакторов проявляетсяпри контактеМФ иммунизированныхморских свинокс 37°-культурами,содержащимифракцию I,что позволяетпредположитьтакже и специфическийэлемент действияэтого антигена,направленныйна усилениезахвата бактерийуказаннымифагоцитами.

Иными словами,данные экспериментовсвидетельствуют,что помимофракции I,возбудительчумы, выращенныйпри 37 °С, содержиткомпоненты,снижающиефагоцитарнуюактивностьМФ интактныхи иммунизированныхживотных, икомпоненты,специфическиспособствующиезахвату бактерийМФ морскихсвинок. Действиепоследнихчастично илиполностью вприсутствиифракции Iнейтрализуетэффект неидентифицированныхнегативныхфакторов. ФракцияIспособствуетзахвату бактерийчумы МФ и болеезначима дляморских свинок.

В общемвиде выводыпо данномуэкспериментуможно сделатьследующие:1. Иммунизациячумной вакцинойморских свинокиндуцируетспецифическуюв отношениифракции Iперестройкув макрофагах,обусловливающуюусиление захватаи перевариванияFra⁺-Y.pestisвыросших при37 °С. Подобногоне происходиту белых мышей.

2. ДефектY.pestisпо fra-генами отсутствиефракции Iобусловливаютболее выраженноеснижениеэффективностизахвата бактерий,выращенныхпри 37 °С макрофагамиморских сви-

нок, но не белыхмышей и большуюстепень перевариваниямакрофагамиморских свинокпри всех условияхопыта, а макрофагамибелых мышей— только в отношении37°-культур.

3. Как в захвате,так и завершениифагоцитозароль фракцииболее существеннав макрофагахморских свинок.

ВЛИЯНИЕМОДИФИКАТОРОВБИОЛОГИЧЕСКОГООТВЕТА ПРИРОДНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯНА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮАКТИВНОСТЬМАКРОФАГОВ

(ОНКОЛОГИЧЕСКИЙАСПЕКТ)

Несмотряна значительныеуспехи химиотерапиинекоторых видовзлокачественныхновообразований,результатыпримененияпротивоопухолевыххимиопрепаратовпри наиболеераспространенныхлокализацияхрака остаютсямалоудовлетворительными.Становитсявсе более очевидным,что одним изосновных препятствийдля успешнойхимиотерапиизлокачественныхопухолей являетсягетерогенностьпопуляциинеопластическихклеток, котораявыражается,в частности,в наличии в нейклонов клеток,резистентныхк химиотерапевтиче-скимагентам. Болеетого, такаярезистентностьможет относитьсяк целым классампрепаратов,что можетограничиватьэффективностьи комплекснойполихимиотерапии.Еще более осложняетположениегенетическаянестабильностьопухолевыхклеток, которые,имея высокийуровень спонтанныхмутаций, чрезвычайнолегко подвергаютсямутагенномувоздействиюхимиопрепаратови продуктових метаболизма.Это в значительноймере усиливаетгетерогенностьопухолевойпопуляции,способствуетгенерации ещебольшего числарезистентныхк химиотерапииклонов, усиливаетих способностьк метастизированию,рецидиву нафоне продолжающейсяхимиотерапии.

В конечномсчете дажевесьма радикальная(на 99,5 %) редукцияопухолевоймассы в процессехимиотерапиипочти неизбежноприводит квозобновлениюпроцесса засчет резистентныхклонов —предшествовавшихили возникшихв процессехимиотерапии.Более того,такие клоныоказываютсяв далеко зашедшейстадии опухолевойпрогрессиии, следовательно,более злокачественными.

В этих условияхвполне закономернымипредставляютсяпоиски путейэлиминацииопухолевыхклеток с такназываемоймножественнойлекарственнойустойчивостьюс помощью другихмеханизмов,в частностилитическогопотенциалаиммунокомпетентныхклеток. Особыйинтерес в этомотношениипредставляютмакрофаги. Вотличие отдругих типовиммуноцитових активностьв меньшей степениподавляетсяв процессеинтенсивнойциторедуктивнойтерапии, ониспособны кэффективнымпротивоопухолевымреакциям всоотношенииэффектор/мишень,приближающемсяк 1:1 и, инфильтрируяопухолевуюстрому, имеютдостаточнуювозможностьдля контактас опухолевойклеткой. Показанавозможностьактивациицитолитическогодействия макрофаговс помощьюразличныхмодификаторовбиологическогоответа (МБО)после воздействияпротивоопухолевыххимиопрепаратов,в то время какактивностьдругих эффекторныхсистем можетбыть существенноподавлена.Поэтому в настоящеевремя идетактивная разработкаметодов адъювантнойиммунотерапиис включениемактиваторовмакрофагов.При этом предварительнаяоценка эффектапоследнихпроводитсяinvitroи в основномпо способностииндуцироватьцитолитическуюи цитостатическуюактивность.По сохранениютакой способностив процессепримененияхимиотерапевтическихпротивоопухолевыхпрепаратовоцениваетсяи «совместимость»МБО с ними. Однакоиндукцияцитотоксичностиявляется толькоодной сторонойактивациимакрофагов,под влияниемМБО происходятдругие значительныеизмененияфункциональнойактивностиэтих клеток,в частностиусиливаетсяпродукция исекреция целогоряда ростовыхфакторов.В рамкахтакого подходабыло изученовлияние БЦЖи циклофосфамидана перитонеальныемакрофагимышей. Названныепрепаратывыбраны какмодельные ввиду их достаточнойизученностикак индукторовпротивоопухолевойактивностимакрофаговinvitroи invivo,а также достаточноширокого примененияв клиническойпрактике.

Известно,что цитотоксическаяактивностьмакрофаговinvitroдостигаетсвоего максимумак 48—72 ч культивирования,а затем быстроснижается.Была проведенаоценка ростстимулирующейактивностирезидентныхи БЦЖ-активированныхмакрофаговв процессекультивированияinvitro.

Установлено,что способностьподдерживатьрост опухолевыхклеток прогрессивноснижается урезидентныхмакрофагови нарастаету БЦЖ-активированных.Если в первые3 дня приростчисла клетокна БЦЖ-активированныхмакрофагахдостовернониже, чем нарезидентных(что может бытьобъясненоцитотоксическойактивностью),то затем наблюдаетсяпротивоположнаяситуация.

Таким образом,если индуцированнаяБЦЖ-активацияпротивоопухолевойактивностимакрофаговносит преходящийхарактер, тоактивацияпродукцииростовых факторовболее устойчиваво времени.Более того, притестированиицитотоксическойи ростстимулирующейактивностимакрофагов,выделяемыхиз перитонеальнойполости мышейв различныесроки послевведения БЦЖ,было выявлено,что цитотоксическаяактивность(цитолитическаяи цитостатическая)максимальнана 10-й день. На15-й и 20-й дни проявляетсятолько цитолитическая,а цитостатическаяактивностьисчезает.Ростстимулирующаяактивностьмаксимальнана 15-й и 20-й дни.Следовательно,invitro активациямакрофаговБЦЖ приводитк транзиторнойэкспрессиипротивоопухолевойактивностии длительнойустойчивойростстимулирующейактивности.

С учетомэтих данныхстановитсяпонятным характервзаимодействияБЦЖ-активированныхмакрофагови опухолевыхклеток в процесседлительногоко-культивированияinvitro:в первые дниза счет цитотоксичностизначительноснижаетсяколичествожизнеспособныхклеток, одновременноцитостатическиефакторы тормозятих пролиферацию,но затем благодарявыделяемымростовымфактораминтенсивностьпролиферациивыжившихопухолевыхклеток значительнопревышаеттаковую у резидентныхмакрофагов,в результатечего их общееколичестводостигает идаже превышаетисходный уровень.

В ряде случаевпри культивированиималых доз опухолевыхклеток — до 10на лунку (т. е.в соотношенииэффектор/мишень5000:1) — цитотоксическойактивностиможет бытьдостаточнодля элиминациивсей опухолевойпопуляции,однако в техслучаях, когдаростовая фракцияпревыситопределенныйпорог цитотоксическойактивности,наблюдаетсяинтенсивныйрост оставшихсяопухолевыхклеток. Именноэто объясняетотсутствиедостоверностирезультатовкультивированиямалых доз клеток,так как отклоненияот среднейвеличины отличалисьбольшей амплитудой.

Таким образом,способностьмакрофагов,активированныхБЦЖ, контролироватьрост опухолевыхклеток invitroограниченаи проявляетсятолько в соотношенияхэффектор/мишень,весьма далекихот реальновозможногоinvivo,—500:1 — 5000:1. При этомпротивоопухолеваяактивностьтранзиторна,а опухольстимулирующаяносит болеедлительныйи устойчивыйхарактер. Поэтомубыла предпринятапопытка потенцироватьпротивоопухолевуюактивностьБЦЖ-активированныхмакрофаговпутем воздействияна них циклофосфамидом.По данным литературы,этот противоопухолевыйпрепарат являетсявполне «совместимым»с БЦЖ-агентом(т. е. стимулируетБЦЖ-индуцированнуюцитотоксичность)и, следовательно,может бытькомпонентомкомбинированнойхимиоиммунотерапиина основе примененияБЦЖ .

Циклофосфамидвводили мышамвнутрибрюшиннов дозе 200 мг/кг,за 9 дней до тогополучившихтакже внутрибрюшинно1 мг БЦЖ. На следующийдень перитонеальныеклетки выделялии оценивалиих цитотоксическуюактивность,способностьподдерживатьрост опухолевыхклеток в субоптимальныхконцентрацияхи влиять нарост автономнорастущей опухолевойпопуляции вусловияхко-культивирования.Оказалось, чтоциклофосфамидсамостоятельноиндуцировалсущественнуюцитолитическуюи цитостатиче-скуюактивности,кроме того,достоверноусиливалБЦЖ-индуцированнуюцитотоксичность..При этом вприсутствиимакрофагов,активированныхкомбинациейБЦЖ с циклофосфамидом,уровень пролиферацииопухолевыхклеток в зависимыхот ростовыхфакторовконцентрациях(10²клеток на лунку)был 2,9'10⁴±3,25-10³и значительнопревышал таковойпри культивированииопухолевыхклеток наБЦЖ-активированныхмакрофагах— 3,7-10³±1,4-10²,практическине отличаясьот их роста вприсутствиинестимулированныхмакрофагов— 3,2-10⁴±4,82-10³.

Таким образом,несмотря навесьма высокийуровень цитотоксичностимакрофагов,индуцированныйих обработкойвслед за БЦЖеще и циклофосфамидом,такие макрофагитеряли способностьдаже к ограниченномуконтролюко-куль-тивируемойс ними популяцииопухолевыхклеток.

С учетомвесьма значительнойв этой серииэкспериментовпотери клетокпод влияниемфакторовцитотоксичности(в отдельныхопытах цитолитическаяактивностьдостигала 70 %)и приростаклеток, сравнимогос таковым послеко-культивированияна резидентныхмакрофагах,можно считать,что совместноеприменениеБЦЖ и циклофосфамидаоказываетаддитивноедействие напродукциюростовых факторовмакрофагами.

Таким образом,имеющиеся влитературеданные о совместимостиБЦЖ и циклофосфамида,будучи совершенносправедливымив отношениипротивоопухолевойактивностиактивированныхмакрофагов,не отражаютвозможногоконечногорезультататакого совмещения,явно нежелательногос клиническойточки зрения.Следует отметить,что характерответа макрофаговна активациюМБО invivoимеет сходствос таковым invitro.Как показаноеще в первыхработах поприменениюБЦЖ, иммунотерапияэтим препаратомэффективнатолько в течениекороткогосрока, а затемпроисходитстимуляцияопухолевогопроцесса, причемпротивоопухолевуюактивностьмакрофагов,достаточнобыстро угасающуюкак invitro,так и invivo,как правило,не удаетсявосстановитьповторнымивведениямипрепарата, еевызвавшего,и в случае успехатакая реактивациякратковременна.

Данныелитературыдостаточнооднозначноуказываютна отсутствиекорреляциимежду цитотоксическойактивностьюБЦЖ-активированныхмакрофаговinvitroи их влияниемна опухолевыеклетки in.vivo.Если исходитьиз представленныхнами данных,это становитсявполне объяснимым:уничтожениеinvitroдаже большинстваопухолевыхклеток припоследующемстимулированиироста оставшихсяприводит кявному нивелированиюэффекта цитолитическогодействия, особенноесли учестьего относительнуюкратковременностьпо сравнениюс ростстимулирующимдействием.Кроме того,выявляемаяinvitroцито-статистическаяактивностьзависит оттаких факторов,как аргиназа,истощениекультуральнойсреды ввидуповышенногометаболизмаактивированныхмакрофагов,продукциятоксическихрадикалов,атомарногокислорода идр. В условияхinvivoэти эффектымогут не проявлятьсяв связи с притокомаргинина, другихпитательныхвеществ к клеткам,наличием антагонистоврадикалови т. д.

Как известно,при опухолевомпроцессе макрофагиспособствуютразвитию опухолина «органном»уровне путемулучшениямикроокружения(имеется в видустимуляцияангиогенеза,формированиестромы опухоли,элиминацияпродуктовраспада опухолевыхклеток). Продуцируемыемакрофагамииммуносупрессивныефакторы, в частностипростагландинЕ2, способныинактивироватьдругие иммунологическиемеханизмырези-стентностик опухолевомуросту. Такиефакторы, какинтерлейкин-1(ИЛ-1), факторнекроза опухоли(ФНО), выделяемыеактивированнымимакрофагами,способны подавлятьпролиферациюбольшей частиизвестных линийопухолевыхклеток, однакоони являютсяи стимуляторамироста некоторыхиз них .

Учитываявысокую степеньгетерогенностиопухолевойпопуляции иусиление ростатаковой подвлиянием продуктовактивированныхмакрофагов,нельзя исключитьпоявленияустойчивыхи даже зависимыхот ФНО и ИЛ-2 клонов.И если в относительнонепродолжительныхдо временисроках взаимодействиямакрофагови опухолевыхклеток в условияхэкспериментальныхмоделей такиеэффекты непроявятся, тов реальныхусловияхвероятностьютакого отборапренебрегатьнельзя. Этоособенно актуально,если учитывать,что макрофагипрактическинеизбежнововлекаютсяв реализациюлюбого иммунотерапевтическоговоздействия,поэтомупродемонстрированныездесь негативныепоследствияих активациимогут сказатьсяи на эффективностивсей программыиммунотерапии,направленнойизначальнона другие эффекторыиммунной системы.

Таким образом,продукциямакрофагамифакторов,стимулирующихрост опухолевыхклеток, являетсявесьма существеннымкомпонентомответа этихклеток на МБО.Соответственнопри оценке иотборе потенциальныхМБО необходимооцениватьне только ихспособностьк индукциипротивоопухолевыхреакций, но ивозможностьэкспрессиипобочнойростстимулирующейактивности.Только углубленноеизучение этоговопроса., направленногона выявлениефакторов,стимулирующихрост опухолевыхклеток, путейих биосинтезав макрофагахи их регуляцию,может лечь воснову разработкиметодов селективногоподавлениянежелательныхв онкологическойситуацииростстимулирующихсвойств активированныхМБО макрофаговпри одновременнойсохранностии активацииих противоопухолевойактивности.

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕМАКРОФАГИ КАКМОДЕЛЬ ДЛЯИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО

ПОТЕНЦИАЛАСЫВОРОТКИ КРОВИ

Накоплениелипидов вгладкомышечныхклетках (ГМК)и макрофагахинтимы аортыявляется характернойчертой атеросклерозачеловека иэкспериментальныхживотных. Былопоказано, чтосыворотки кровибольных ишемическойболезнью сердца(ИБС) с ангиографи-ческиподтвержденнымкоронарныматеросклерозомв отличие отсывороток кровиздоровых лицобладают способностьювызывать накоплениелипидов вкультивируемыхклетках интимыаорты человека.Это свойствобыло названоатерогенностью,посколькунакоплениелипидов сопровождалосьдругимиатеросклеротическимипроявлениямина клеточномуровне — усилениемпролиферативнойактивностии синтезавнеклеточногоматрикса. Однакосвязь междуатерогенностьюи атеросклерозомокончательноне выяснена.

Исследованияпо этой проблемеоснованы напервичномкультивированиисубэндотелиальныхклеток интимыаорты человека.Сложностьработы обусловленанеобходимостьюпостоянногообеспечениястерильнымаутопсийнымматериалом,а также высокойстоимостьювыделения икультивированияклеток.

Ранее былопоказано, чтоспособностьюаккумулироватьвнутриклеточнохолестеринпри культивированиис атерогеннойсывороткойобладают ГМКаорты человекаи мононуклеарныеклетки периферическойкрови. Эти данныепозволяютсчитать, чтодля определенияатеро-генностисыворотки кровимогут бытьиспользованыне толькосубэндотелиальныеклетки интимыаорты.

Целью работыбыло определениевозможностииспользованиялегкодоступныхперитонеальныхмакрофаговдля определенияатерогенностисывороткикрови.

Кровь дляисследованийбы взята у больныхИБС, подтвержденнойпри коронарнойангиографии,и здоровыхдоноров. ГМКбыли выделеныиз аорты мужчин,взятой в асептическихусловиях спустя24 ч после внезапнойсмерти, ступившейот инфарктамиокарда.Человеческиеперитонеальныемакрофаги быливыделены изасцитическойжидкости больныхнедостаточностьюкровообращения.Мышиные перитонеальныеМФ полученыот нестимулированныхмышей.

Влияниесыворотки кровиздоровых донорови больныхИБСна уровеньхолестеринав клетках

Типклеток	Контроль,мкг	Уровеньхолестеринав клетках, %контрольныхвеличин
	на 1 мгбелка	здоровыедоноры	больные ИБС

ГМК:

интимыаорты

59±5110±7370±43

67±4118±13179±10

32±395±8264±31

44±4108±3284±28

медииаорты

Мышиныемакрофаги

Человеческие макрофаги

В таблицеприведеносодержаниеобщего холестеринав ГМК интимыи медии аортычеловека, вперитонеальныхмышиных ичеловеческихмакрофагах,инкубированных24 ч в присутствии20 % сыворотоккрови здоровыхдоноров и больныхИБС. Видно, чтоинкубацияклеток в 20 % сывороткекрови здоровыхдоноров неприводит кстатистическизначимомуповышениюуровня холестеринав клетках, аинкубация в20 % сывороткекрови больныхИБС вызываетдостоверноеповышениесодержаниявнутриклеточногохолестеринакак в ГМК, таки в перитонеальныхмакрофагах.Таким образом,так же, как ГМКинтимы и медииаорты, перитонеальныемакрофаги мышейи человекамогут бытьиспользованыдля оценкиатерогенногопотенциаласывороткикрови. Крометого, накоплениехолестеринав макрофагахпроисходитв 1,5—2,5 раза быстрее,чем в ГМК. Обаэти факта, атакже болеелегкий способполучениякультуры макрофаговпозволяютсчитать, чтоэти клеткимогут бытьиспользованыдля оценкиатерогенногопотенциаласыворотки кровизначительночаще, чем ГМК.

При культивированиимышиных, человеческихмакрофагови ГМК с 10 атерогеннымии 10 неатерогеннымисывороткамикрови установленапрямая корреляционнаясвязь междуаккумуляциейхолестеринав макрофагахи в ГМК интимыаорты. Крометого, аккумуляцияхолестеринав человеческихи мышиных макрофагахнаходится впрямой зависимостиот концентрациисыворотки (рис1) и временикультивирования(рис 1А). Прикультивированиимакрофаговс сывороткойздоровых лицтакого эффектане выявлено.

Во время инкубациичеловеческихи мышиных макрофаговс сывороткамикрови больныхИБС выявленоповышениесодержанияв клетке свободногохолестеринаи триглицеридовв 1,5— 2 раза, эфировхолестеринав 2,5—3 раза. Приэтом. уровеньфосфолипидовне изменялся.

В группездоровых доноровтолько у 22 (28 %) из80 человек сывороткикрови вызывалиаккумуляциюхолестеринав культуреклеток. В группебольных ИБСу 83 % человексывороткикрови вызывалидостоверноеповышениеуровня общегохолестеринав макрофагах,т. е. обладалиатерогеннымисвойствами.

Не выявленокорреляциимежду атерогенностьюкрови больныхИБС и содержаниемв сывороткеобщего холестерина,триглицеридов,апо-А1, апо-В иХС ЛПВП.

Полученныеданные свидетельствуюто наличии прямойкорреляциимежду аккумуляциейлипидов в ГМКи макрофагах,а также о том,что способностьвыявлятьатерогенностьсывороткикрови. Прииспользованииперитонеальныхмакрофаговне отличаетсяот данных, полученныхранее прииспользованииГМК интимыаорты. Во времякультивированияперитонеальныемакрофагиаккумулируютсвободный иэстерифицированныйхолестерин,триглицериды,т. е. те же липиды,которые приинкубациивключают в себяГМК интимыаорты. ИспользованиеГМК затрудненоиз-за сложностейполученияасептическогоматериала вдостаточномдля работыобъеме. Человеческиеи особенномышиные макрофагилишены этихнедостатков.Эти факты доказывают,что культураперитонеальныхмакрофаговвместе с культуройГМК интимыаорты можетбыть использованакак тест-системадля оценкиатерогенногопотенциаласывороткикрови.

Макрофаги,возможно, являютсяодним из главныхклеточныхакцепторовлипидов в сосудистойстенке. Давноуже было показаноналичие макрофагов,насыщенныхлипидами, ватеросклеротическихбляшках. Экспериментальныеработы, в которыхиспользоваласькультура клеток,выявили способностьмакрофаговинтенсивнонакапливатьэфиры холестеринапри инкубациис химическимодифицированнымилипопротеидами.

Использованиекультуры макрофаговпозволит продолжитьизучение природыатерогенностисыворотки кровибольных ИБСи ее роли впатогенезеатеросклероза.

Рис.1 Связь междунакоплениемхолестеринав клетках иконцентрациейсыворотки

По оси абсцисс— концентрациясыворотки (в%);по оси ординат— содержаниехолестерина(в мкг на 1 мг белка)в человеческих(а) и мышиных(б) макрофагах./,2 —культивированиев сывороткахздоровыхдоноров,3,4—больных ИБС.

Рис.1АСвязь междунакоплениемхолестеринав клетках ивременем инкубации.

По осиабсцисс—времяинкубации (вч). Остальныеобозначенияте же, что и нарис 1

ВЛИЯНИЕ ГАМК,ГОМК И ГЛУТАМИНОВОИКИСЛОТЫ НАФУНКЦИОНАЛЬНУЮ

АКТИВНОСТЬФАГОЦИТОВ

За последниегоды проводитсяинтенсивноеизучение ролинейроактивныхаминокислотв иммунологическихпроцессах. Этосвязано с широкимиспользованиемданных аминокислотв неврологическойи психиатрическойпрактике, однакоодновременнос их прямымиэффектамиполучены данныеоб их влияниина иммунологическиепроцессы.Получены данныео влияниигамма-аминомасляной(ГАМК), гамма-оксимасляной (ГОМК) и глутаминовойкислот на количествоантителообразующих,розеткообразующихклеток идругие показателииммунитета.Опыты проводилисьв двух сериях:в I серии наинтактныхмышахизучалосьвлияние нейроактивныхаминокислотна функциональноесостояние МФи нейтрофилов.Во II серии влияниетех же веществна состояниефагоцитовизучалось нафоне предварительнойиммунизацииживотных. Иммунизациюпроводили 5%взвесью эритроцитовбарана в количестве1 мл на 3-й деньпосле введенияпрепарата.Контрольнуюгруппу составлялиинтактныемыши, получавшиефизиологическийраствор (контрольI), и животные,получавшиефизиологическийраствор ииммунизированныеэритроцитыбарана(контроль II).

Введение интактнымживотным (I серия)нейроактивныхаминокислотсопровождалосьсущественнымисдвигами активностикислой фосфатазыв МФ и нейтрофильныхлейкоцитах.Необходимоотметить, чтоизменениеактивностив изученныхгруппах носилоразнонаправленныйхарактер. Так,в условияхвведения ГАМКактивностьфермента в МФи лейкоцитахкрови повышаласьпо сравнениюс контрольнойгруппой в 1,7 раза,при введенииже ГОМК происходилодостоверноеснижение активности кислой фосфатазылишь в МФ. Показателиактивностифермента привведении интактныммышам глутаминовойкислоты неотличалисьот таковыхконтрольнойгруппы.

Изучение влияниябиологическиактивных веществна фоне предварительнойиммунизацииэритроцитамибарана во всехопытных группахII серии выявилосущественноепонижениеактивностикислой фосфотазыв нейтрофильныхлейкоцитах.Относительнонизкие показателиактивностив изучаемыхклетках кровибыли зарегистрированыпри введенииГОМК и глутаминовойкислоты, которыебыли нижесоответственнов 2 и 1,4 раза контрольногоуровня. Активностьизучаемогофермента в МФопытных группII серии не отличаласьот таковой вконтроле, заисключениемгруппы, в которойна фоне иммунизациивводили ГОМК,где содержаниекислой фосфатазыпонижалосьпочти в 2 раза.

В серии проведенныхцитологическихисследованийбыло установлено,что нейроактивныеаминокислотыв испытуемыхдозах не вызываютв клеткахфагоцитарногоряда дистрофическихи деструктивныхизменений. Так,ни в одной изучаемойгруппе I сериине было выявленопризнаковраспада, фрагментациии лизиса цитоплазмическойи ядерной мембран,пикноза и рексисаядер. В то жевремя в группах,где вводилиГАМК и ГОМК,ядра моноцитоввыгляделигипертрофированнымии гипохромными,цитоплазма—умеренновакуолизированной.Не исключено,что нейроактивныеаминокислотыв биологическидопустимыхдозах не оказываютцитотоксическоговлияния намоноциты инейтрофильныелейкоцитыв крови интактныхмышей. Однакосущественныесдвиги в активностиосновногомаркёра лизосом—кислойфосфатазынаводят намысль, что изучаемыебиологическиактивные вещества,не оказываянепосредственноготоксическогодействия наклеточнуюмембрану, вызываютвсе-таки дестабилизациювнутриклеточныхмембранныхструктур, и, впервую очередь,лизосомальных.Принимая вовнимание тообстоятельство,что активностьлизосомальныхферментов вомногом зависитот функциональногосостояниямембран, а точнее—отстепени еёпроницаемости,была проведенаспециальнаясерия экспериментовпо изучениюпроницаемостилизосомальныхмембран припомощи прижизненногофлюорохромированияфагоцитовакридиновыморанжевым (АО).Результатыисследованийс применениемАО показали,что изменениетинкториальныхсвойств клеток-мишенейнаблюдалосьпри введениив организммышей всехисследуемыхнейроактивиыхаминокислот.При введенииГАМК, ГОМК иглутаминовойкислоты периодполураспада(Т _1/2) заметносокращается,а при экспозицииТ '/а, в течениекоторого происходитпоэтапноеизменениетинкторнальныхсвойств составныхкомпонентовклеток (цитоплазма,ядро, участкилокализациилизосом), количествофагоцитов сзеленой флюоресценциейядер в опытныхгруппах I сериидостоверноснижалось.Аналогичнаянаправленностьчетко прослеживаласьво всех опытныхгруппах II серии.

Резюмируявышеизложенное,можно заключить,что нейроактивныеаминокислотыоказываютсущественноевлияние наактивностькислой фосфатазыв фагоцитах.Особо следуетотметить, чтополученныйэффект в группахвведения ГАМКи ГОМК былдиаметральнопротивоположным:этот фактпрослеживаетсянаиболее четков тех случаях,когда в качествеобъекта изученияактивностикислой фосфатазывыступали МФ.Введение жеГАМК и глутаминовойкислоты на фонепредварительнойиммунизациине отражалосьна активностикислой фосфатазыв МФ, в то времякак в нейтрофильныхлейкоцитахвсе изучаемыенейроактивныеаминокислотывызывали достоверноепонижениеактивностифермента.

Экспериментыс применениемв качествеиндикаторапроницаемостилизосомальныхмембран АОпоказали, чтонейроактнвныеаминокислоты,не обладаяцитодеструктивнымдействием паклетки-мишени,вызываютдестабилизациюлизосомальныхмембран, направленнуюв сторону увеличенияих проницаемости.Сопоставлениепоказателейпроницаемостилизосомальныхмембран животныхI и II серий показывает,что для повышенияпроницаемостипод влияниемнейроактивныхаминокислотформированиегуморальногоиммунитетаявляется условиемнеобязательным.

Таким образом,нейроактивныеаминокислотыоказывают избирательноевлияние наморфофункциональноесостояниелизосомальногоаппарата фагоцитов.Это подтверждаетсяполученнымиданными опроницаемостилизосомальных мембран в отношениитоксическогокрасителя иколичественногоопределенияактивностиосновногомаркера лизосом– кислой фосфотазы.

IV.Заключение

Приведеннаялишь малаячасть экспериментовпо моделированиюразличныхвоздействий,говорит в пользутого, что процессынарушений илиизмененияфагоцитирующейактивностиочень удобноизучать путемпостановкиопытов наперитонеальныхМФ. Можно сказать,что даннаямодель давностала базовойдля проверкиразнообразныххимическихи фармакологическихпрепаратовв качествеагентов, воздействующихна клеточноезвено иммунитета;для изученияпроцессоввзаимодействияинфекционныхагентов с фагоцитами. Также онаиспользуетсядля изученияне толькофагоцитарнойфункции – нои наоборот,различных процессов,связанных ссамими инфекционнымиагентами. Можноупомянуть, чтопроводятсяисследования по изучениюфагоцитовперитонеальногоэкссудата угенетическидиабетическихмышей, у генетическииммунодепрессивныхкрыс и т.д.

Конечно теданные, которыеполучаютисследователидостаточноотносительны,ведь несмотряна высокоекачество проводимыхопытов, они всеже проводятсяin vitro,что неизменнонакладываетсвой отпечаток– клетки здесьлишены тойгаммы цитокиновыхвоздействий,которая присутствуетв живом организме,они не взаимодействуютсо стромальнымикомпонентамии другими клетками.Достоинствомметода являетсяего простота,доступностьи, что немаловажно,наглядность,а также высокаяскорость получениярезультатови широкие возможностипо постановке«регистрационных»реакций. Однако,как видно, этимв современной патологии мыне можем ограничиться.Поэтому в современныхнаучных иклиническихисследованияхприменяют идругие методыи модели. О некоторыхиз них краткобудет рассказанониже.

НЕКОТОРЫЕДРУГИЕ МОДЕЛИИЗУЧЕНИЯ ФАГОЦИТОЗА.

Одна из самыхреалистичныхмоделей фагоцитоза– это модельin vivo. Данная модельпозволяетполучать достовернуюинформациюи моделироватьпроцессы сучетом влияниявнутреннейсреды. Однакоона более сложнав реализациии порой не даетвозможностиработать сорганизмомчеловека. Модельin vivoсуществуетв двух вариантах
1. Модель на фагоцитахсывороткикрови. Конечно,в этом случаеобъектом нашеговнимания будутне МФ, а моноцитыкрови и нейтрофильныелейкоциты.Модель позволяетизучать влияниена состояниефагоцитов ифагоцитарнойфункции общих,системныхпроцессов,таких как гипоксия,гипобария,радиация ипроч. Такжепутем внутрисосудистоговведения различныхвеществ можнополучить данныхоб их воздействии.Изучаетсявлияние ивнутреннихсистемныхактивных веществ:гистамина,простогландинов
2. Модель фагоцитозав очаге хроническоговоспаления.Одна из самых«клинических»моделей. Здесьобъектом вниманияявляются кактканевые МФ,так и эпителиоидныеклетки, гигантскиемногоядерныеклетки, клеткиинородных тел и др. Большоевнимание уделяетсяявлению незавершенногофагоцитоза,процессамподавлениямиграции, снижениякислород-зависимойцитотоксичности.
Очень оригинальнаямодель быларазработанав лабораториииммунологииИнститутаакушерстваи гинекологииим. Отта РАМН(авторы:О.А.Павлов,С.А.Сельков,А.В.Селютин,Е.Е.Андрееваи др.). Они изучалироль плацентарныхМФ в проблемахродовой деятельностии, особенно –в проблеменевынашиваниябеременности.Макрофагамфетоплацсптарногокомплекса(МФК), по мнениюисследователей, до недавнеговремени уделялосьнеоправданномало внимания.Лишь в последниегоды появилсяряд публикаций,посвященныхэтим клеткам.Многие функцииМФК толькопредстоитвыяснить, однакоуже сейчасстановитсяочевидным, чтосреди популяцийразличныхклеток, составляющихткань плаценты,МФК являютсянаиболее вероятнымикандидатамина роль регуляторного(а, возможно,и ключевого)звена в рядерепродуктивныхпроцессов.С точки зренияпатогенезаразвития родовойдеятельностипри преждевременныхи срочных родахМФК представляютособый интересв силу особенностейряда свойстви положенияэтих клеток.

Плацентарныемакрофаги(клетки Кащенко—Гофбауэра)принадлежатк системемононуклеарпыхфагоцитов,имеющих единоепроисхождениес обычными МФ.Эти клетки взначительномколичествесодержатсяв ткани плацентыи составляютподавляющеебольшинствоее иммунокомпетентныхклеток. По даннымнекоторыхавторов, макрофагисоставляютдо 40% популяциинетрофобластныхклеток ворсинхориона.

Традиционносчиталось, чтопрерогативоймононуклеарныхфагоцитов вфетоплацентарномкомплексеявляется удалениеклеточногодетрита, защитаот микроорганизмов,участие в системезащиты плодаот местногоматеринскогоиммунногоответа. Онитакже участвуютв реализациии модуляциииммунногоответа и представляютпервую линиюзащиты противинфекции,обеспечиваянеспецифическиеиммунные реакциии продуцируярегуляторныесигналы дляспецифических.Таким образом,уникальностьположения МФКсостоит в том,что, с однойстороны, они,как эффекторныеклетки, вступаютв непосредственныйконтакт синфекционнымиагентами ииными продуктами,проникающимив организмхозяина (в данномслучае в единуюсистему"мать—плацента—плод"),а, с другой стороны,будучи активированнымив результатеэтого контакта,способныпродуцироватьмножестворастворимыхсигнальныхмолекул, влияющихна функцииблизлежащихклеток.

В число этихфакторов входяти цитокины,содержаниекоторых меняетсяс началом спонтаннойродовой деятельности— ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6и ИЛ-8. Предполагается,что эти цитокины,продуцируемыемакрофагами,стимулируютсинтез ПГ и темсамым инициируютсократительнуюактивностьматки. Болеетого, показано,что макрофагимогут самостоятельнопродуцироватьПГЕ2 ПГ2а, которыенепосредственновоздействуютна миометрий.Макрофаги такжеспособны ксекрециитрансформирующегоростовогофактора-β (ТРФ-β),который играетважную рольв эмбриональномморфогенезе и влияет нафункции клетоктрофобластаи эндометрия.Недавно вэкспериментахin vitroполучены убедительныедоказательстваучастия клетокплаценты впроцессе родов.Авторы продемонстрировалисвязанное сродовой деятельностьюувеличениесекреции ФНО-αмакрофагами,взятых у женщинв результатеспонтанныхродов илииндуцированныхродов путемискусственнородоразрешения,а также ИЛ-1 иИЛ-6 эндотелиальнымиклетками плаценты.Все эти данныесвидетельствуюто вкладе клетокплаценты, в томчисле макрофагов,в повышениеуровня цитокиновв пределахфетоплацентарногокомплекса приспонтаннойродовой деятельности.Предположенияо возможнойроли ПМ в преждевременноми срочномродоразрешении заставляютвзглянуть наэту клеточнуюпопуляцию какна важнейшийэлемент, оказывающийвлияние нагестационныепроцессы. Вэтой связиактивация ПМможет рассматриватьсякак событие,ведущее кпреждевременнымили срочнымродам. Установленаположительнаякорреляциямежду повышениемуровня некоторыхцитокинов(туморнекротизирующийфактор-α, интерлейкин-1и -6), которыесекретируютсяв том числеактивированнымимакрофагами,и наступлениемпреждевременныхи срочных родов. Попыталисьвыявить связьмежду наличиемродовой деятельностина разных срокахбеременностии степеньюактивации ПМin vitro,о которой судилипо уровню экспрессииантигеновМНС II ифагоцитарнойактивностиклеток, опосредованнойFс- и СЗ-рецепторами.при наличииродовой деятельности.Увеличивалось количествоклеток, экспрессирующихМНС II и СКЗ иобладающихспособностьюк фагоцитозу.На более позднихсроках беременностине удалосьвыявить достоверногоувеличенияактивностиПМ при родовойдеятельности.Согласно даннымснижение уровняфагоцитоза происходилоза счет сниженияактивностиотдельнойклетки, в товремя как количествофагоцитовсущественноне изменялось.Для того, чтобывыяснить, отражаетли наблюдаемаятенденциясуществующуюзакономерность,или являетсяследствиемнеоднородностиисследуемогоматериала,необходимоисследоватьдополнительноеколичествоплацент.

Полученныерезультатысвидетельствуюто перспективностипримененияобогащенныхкультур ПМдля изученияряда аспектовиммунологииирепродукции,в частностидля выясненияклеточныхмеханизмов,лежащих в основенормальныхи преждевременныхродов.

Литература.

Д.И. Маянский,Клетка Купфераи системамононуклеарныхфагоцитов,Москва, 1983
Методыизучения invitroклеточногоиммунитета,под ред. Блумаи Глэйда, Москва,1974
И.И.Мечников,Лекции посравнительнойпатологиивоспаления,Москва, 1947
Терапевтическийархив, 1990, Т62, N11
Вопросы медицинскойхимии, 1988, Т34, Вып.1
Лабораторноедело,1984, N5
Лабораторноедело,1985,N1
Лабораторноедело,1992,N2
Лабораторноедело,1989,N4
Иммунология,1983, N1
Иммунология,1983, N2
Иммунология,1987,N6
Иммунология,1989,N4
Иммунология,1999,N1
Бюллетеньэкспериментальнойбиологии имедицины, 1988, N1
Бюллетеньэкспериментальнойбиологии и медицины, 1989,N11
Бюллетеньэкспериментальнойбиологии имедицины, 1990,N1
Бюллетеньэкспериментальнойбиологии имедицины,2000, Т129,N6
Бюллетеньэкспериментальнойбиологии имедицины,1999, Т127,N4
Журналмикробиологииэпидемиологиии иммунобиологии1990,N5
Архивпатологии,1994, Т56, N1
Медицинскаяиммунология,2001, Т3, N3
Экспериментальнаяи клиническаямедицина, 1989, Т29,N3
Экспериментальнаяи клиническаямедицина, 1989, Т29,N6
Цитология,1992, Т34,N7

Санкт-Петербургскийгосударственныйуниверситет

им.акад. И.П.Павлова

КАФЕДРАПАТОФИЗИОЛОГИИ

РЕФЕРАТ

Макрофагиперитонеальногоэкссудата какмодель

фагоцитоза и нарушений фагоцитарнойактивности

Выполнил

студент КарповС.А.

305 группы лечебногофакультета

ПреподавательСтепанян М.Л.

Санкт-Петербург

2002