л-треонина - 11,9
л-триптафана - 2,0
л-тирозина - 18,1
л-валина - 11,7
биотина - 0,24
холина - 0,12
холин-хлорида - 0,14
витамина В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44
никотинамида - 0,12
пантотеновой кислоты - 0,22
пантотената кальция - 0,48
пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20
тиамин-хлоргидрата - 0,34
рибофлавина - 0,04
хлористого натрия - 5850,0
хлористого калия - 373,0
фосфата натрия однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0
кальция хлористого - 111,0
двууглекислого натрия (NaHCO3) - 1680,0
магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0
глюкозы - 900,0
л-глютамина - 146,2—292,3
пенициллина - 50,0
стрептомицина - 50,0
фенола красного - 5,0
воды до 1000,0
Приготовление.
Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80°, помешивая, растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-глютамин и фенол-красный.
Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим раствором неорганических солей и добавляют биотин и витамин B12.
Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики — пенициллин и стрептомицин. Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч (пористая стеклянная пластина, величина пор 0,7—1,5) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца после предварительного промывания водой, а затем — приготовленным раствором.
500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1 мг инозита на 1 л.
ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.
Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращиваемая invitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить invitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.
На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или ферментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищенная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.
Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов. Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.
Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК.
Как уже отмечалось выше, одним из методов получения перевиваемых клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°.
Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°.
По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.
В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или между стянутыми его участками появляются округленные клеточные элементы, из которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками.
Возникшие в процессе отбора атипичные клеточные элементы должны быть отделены от остальных участков монослоя и перенесены в отдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или механический откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипичных клеток плотно прикреплены к стеклу и сами от него не отделяются.
При смене питательной среды в случае появления атипичных клеток рекомендуется осторожно удалить большую часть ростовой среды, а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.
После переноса культуры атипичных клеток в новую посуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, так как процесс выведения новой клеточной линии весьма сложен, и далеко не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток. Необходимо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий, продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с одними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.
Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).
РОЛЛЕРНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
До недавнего времени тканевые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.
Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого применяли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Широкого распространения эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипуляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С. Ратнером и В. А. Крикуном методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными трубками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На первом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культуральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура.
Более эффективным оказалось вращение сосудов, в которых происходило размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием технического оснащения возросли объемы культуральных сосудов, и от выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи перешли к вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться как для накопления клеток, так и размножения вирусов.
Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производственных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после засева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20—30 об/час).