После распада субъединиц, расщепленная молекула β-ХГЧ теряет С-терминальный пептид (область 93-145 аминокислот) и деградирует до конечного продукта распада ХГЧ – β-кор-фрагмента (два участка β-субъединицы, 6-40 и 55-92, соединенные четырьмя дисульфидными связями) (рис.3). Катаболизм ХГЧ приводит к появлению в крови только расщепленной β-ХГЧ.
Все эти процессы приводят к тому, что в плазме и моче беременных женщин обнаруживается большое количество дериватов (метаболических форм и предшественников) хорионического гонадотропина. Эта группа включает в себя нативный ХГЧ, ХГЧ с расщепленной β-субъединицей, ХГЧ без С-терминального выступа, свободную -субъединицу, свободную гипергликозилированную α-субъединицу, свободную β-субъединицу, расщепленную свободную β-субъединицу и β-кор-фрагмент [23].
Содержание свободной β-субъединицы ХГЧ в биологических жидкостях в норме и при патологии
Концентрации ХГЧ – нативного и с расщепленной β-субъединицей – в плазме крови и моче возрастают в первом триместре беременности, удваиваясь каждые 48 часов, и достигают пика около десятой недели беременности [24]. Концентрация нативного ХГЧ снижается с десятой по шестнадцатую недели беременности, достигая приблизительно 20% от пиковой концентрации, и остается около этого уровня до конца беременности [25]. В среднем ХГЧ с расщепленной β-субъединицей составляет около 9% от всех дериватов ХГЧ в плазме на втором нормальной месяце беременности и возрастает в среднем до 21% на девятом месяце. Несмотря на в среднем низкое содержание расщепленного ХГЧ, индивидуально оно может очень сильно меняться [26]. Изменения концентрации гормона в течение беременности отражают его основную функцию – поддержание продукции прогестерона желтым телом до того как плацента не возьмет эту функцию на себя [27].
Концентрация свободной β-ХГЧ в сыворотке крови беременных очень низка: около десятой недели беременности оно максимально (1-3% от всех дериватов ХГЧ), а к девятому месяцу понижается до 0,5%. Более высокое содержание свободной β-субъединицы наблюдается в моче, где достигает 9% от общего количества дериватов [20].
Содержание в крови и моче ХГЧ с расщепленной β-субъединицей, свободной β-субъединицы и β-кор-фрагмента значительно изменяется при синдроме Дауна у плода, беременности, осложненной преэкламсией (поздним токсикозом) и при трофобластических заболеваниях (пузырном заносе, трофобластических опухолях и хориокарциноме) [28-31, 34].
В пренатальной диагностике корреляция концентрации какого-либо маркера, в том числе свободной β-субъединицы ХГЧ, с патологией оценивается статистически – по вкладу в вероятность рождения больного ребенка, рассчитываемую на основании нескольких факторов. Все факторы риска, биохимические и ультразвуковые, оценивают в единицах МoМ (multiplies of median, кратности медиане). Затем с помощью специальных статистических программ рассчитывается вероятность рождения ребенка с синдромом Дауна с учетом возрастного риска [32, 33].
С 1993 года были проведены скрининговые исследования, в которых была установлена целесообразность использования свободной β-ХГЧ для скрининга синдрома Дауна в первом триместре [8]. Данные этих исследований представлены в табл. 1.
Таблица 1
Содержание свободной β-субъединицы ХГЧ в крови женщин в первом триместре беременности при наличии синдрома Дауна у плода.
| Авторы | Количество случаев синдрома Дауна | Среднее значение (МоМ) |
| Macri e.a. [34] | 38 | 2.20 |
| Macintosh e.a. [35] | 21 | 2.10 |
| Kranz e.a. [8] | 22 | 2.09 |
| Haddow e.a. [36] | 48 | 2.13 |
Таким образом, при синдроме Дауна концентрация свободной β-ХГЧ в 2 с лишним раза выше, чем значение для выборки в целом.
Характеристика эпитопов β-субъединицы ХГЧ
Развитие высокоспецифичных и чувствительных иммунохимических методов для определения свободной β-ХГЧ в крови основано на отборе моноклональных антител, способных отличать свободную β-ХГЧ от остальных метаболитов гормона. Антитела, специфически связывающие свободную β-субъединицу, впервые были получены в 1981 г. [37]. После этого было описано большое количество антител, однако четкое представление о расположении антигенных областей β-ХГЧ появилось только после изучения ее кристаллической структуры. Многочисленные исследования методами биохимической, в т.ч. энзиматической модификации, изучение кросс-реактивности в конкурентных иммуноанализах, с помощью искусственных синтетических пептидов и рентгеноструктурного анализа привели к выяснению эпитопной карты β-ХГЧ, свободной β-субъединицы и продуктов ее деградации.
Установлено, что свободная β-ХГЧ имеет четыре пространственно разделенных антигенных домена [38]. Два из них локализованы в С-терминальной области β-ХГЧ и являются небольшими слабо иммуногенными областями, состоящими каждая из одного эпитопа (113-116 и 137-144 аминокислотные остатки) [39]. Третий домен также представлен одним эпитопом, локализованным вблизи от «цистинового узла» с аргинином в положении 60 в качестве главной детерминанты, и является также слабо иммуногенным. Четвертый домен демонстрирует высокую иммуногенную активность и представлен четырьмя эпитопами в области β-кор-фрагмента. Кроме того, к этому домену также относится один из двух эпитопов, специфичных только для свободной β-ХГЧ (табл. 2) [40].
Таблица 2
Распределение эпитопов на дериватах ХГЧ.
«+» – присутствие эпитопа на молекуле, «–» – отсутствие.
| Эпитоп | ХГЧ | Свободная β-ХГЧ | β-кор-фрагмент |
| β1 | + | + | + |
| β2 | + | + | + |
| β3 | + | + | + |
| β4 | + | + | + |
| β5 | + | + | + |
| β6 | - | + | + |
| β7 | - | + | + |
| β8 | + | + | - |
| β9 | + | + | - |
| β10 | - | - | + |
| β11 | - | - | + |
| β12 | - | - | + |
| β13 | - | - | + |
Из этих данных видно, что на свободной β-ХГЧ выявляются только два эпитопа (β6 и β7), антитела к которым не взаимодействуют с молекулой ХГЧ.
Коммерческие тест-системы для определения содержания свободной β-субъединицы ХГЧ в сыворотке крови
Из вышесказанного ясно, что сложность создания иммунометрической тест-системы для определения концентрации свободной β-ХГЧ связана с большим количеством метаболических форм ХГЧ, содержащихся в крови, и перекрестной реакцией антител с ними. В связи с тем, что β-ХГЧ составляет не более 3% от всех дериватов ХГЧ, для конструирования одностадийной системы необходимы высокочувствительные и специфичные только к свободной β-субъединице антитела [23]. По последним данным, охарактеризовано всего два антитела, специфически связывающиеся со свободной β-ХГЧ (табл. 2).
При обзоре коммерческих тест-систем (табл. 3), оказалось, что только в одной из них используются два антитела, специфичные к свободной β-ХГЧ, что позволило производителю (Wallac OY, Финляндия) [41] создать одностадийный вариант анализа. Все остальные компании предлагают двустадийный анализ. Можно предположить, что во всех этих системах только нижнее антитело имеет специфичность к свободной β-субъединице, а верхнее – к полной молекуле ХГЧ.
Таблица 3
Аналитические характеристики коммерческих тест-систем для определения концентрации свободной β-субъединицы ХГЧ в сыворотке крови («–» означает, что данные не найдены)
| Комания | Антитела | Метод анализа | Диапазон,чувствительность,хук-эффект (мМЕ/мл) |
| Wallac OY, Финляндия | Оба к свободнойβ-ХГЧ | Одностадийный флуороиммуно-метрический | 0-200 0,2 2000 |
| DPC, США | Только нижнее к свободной β-ХГЧ | Двустадийный ИФА | до 80 0,04 нет |
| IBL, Германия | - | Двустадийный ИФА | до 50 0,5 нет |
| Genemed Biotechnologies, США | - | Двустадийный ИФА | 0-250 –– |
Список литературы
Айламазян Э. К. Антенатальная диагностика и коррекция нарушений развития плода// Российский вестник перинаталогии и педиатрии. 1999. №3. с. 6-11.
Гинзбург Б. Г. Динамика частоты синдрома Дауна в разных регионах. //Российский вестник перинаталогии и педиатрии. 2000; №3: с.58.
Wald N. J, Cuckle H. S, Densem J. W. et al. Maternal serum screening for Downs syndrome in early pregnancy // BMJ. 1988; 297: 883-7.
Пренатальная диагностика в акушерстве: современное состояние, методы, перспективы. Методическое пособие под ред. Э.К. Айламазяна. СПб.: Изд-во Н-Л. 2002.
Merkatz I. R. , Nitowsky H. M. , Macri J. N., Johnson W. E. An Association between low maternal serum α-fetoprotein (AFP) and fetal chromosomal abnormalities.//Am. J. Obstet. Gynecol.1984; 148: 886-94.
Bogart H. M., Pandian M. R., Jones O. W. Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in pregnancies with fetal chromosome abnormalities // Prenat. Diagn. 1987; 7: 623-30.
Wald NJ, Watt HC, Hackshaw AK. Integrated screening for downs syndrome based on tests performed during the first and second trimesters. //The New Engl. J. Med. 1999. 341/7: 461-467.
Krantz D.A., Larsen J.W., Buchanan P.D., Macri J.N. First-trimester Down syndrome screening: Free β-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein A // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996; 174: 612-6.
Miller S. M., Isabel J. M. Prenatal screening tests facilitate risk assessment // MlO. 2002. 2: 8-19.
Розен В. Б. Основы эндокринологии. М.: Изд-во МГУ, 1994. с. 89.