Исследования показали, что типичные патоморфологические изменения могут вызвать как капсулообразующие, так и бескапсульные формы возбудителя при большей вирулентности первых.
По нашим данным изменения в лёгких, плевре, перикарде и перитонеуме ассоциируются с локализацией в них возбудителя. Частота изоляции культур H.parasuis из тканей и органов зависит от характера болезни и давности процесса. При остром течении в результате экспериментального (трахеального) заражения через 48-72 часа из лёгких культуры возбудителя выделили в 100% случаев, плевры - 75%, перитонеума и перикарда -25%, бронхиальных лимфатических узлов - 100%, селезёнки - 50%, крови - 25% случаев. При бактериологическом исследовании поросят, павших с картиной острого полисерозита, в естественных условиях культуры возбудителя выделили из лёгких у 42,85%, перикарда - 92,2%, плевры - 71,42%, печени - 57,14%, селезёнки - 66,66% животных. В более отдалённые сроки после экспериментального заражения и от животных, павших в естественных условиях с картиной подострого полисерозита, возбудитель выделяли реже и преимущественно из плевры, лёгких, перикарда, перитонеума и средостенных лимфоузлов.
Анализ возрастной заболеваемости поросят гемофилёзным полисерозитом показал, что пик отхода приходится на возраст 35-60 дней. Появление отхода поросят с явлениями гемофилёзного полисерозита совпадает со снижением титра колостральных антител к H.parasuis (серовар Д), увеличением уровня колонизации возбудителя в респираторном тракте. Согласно полученным данным, H.parasuis является достаточно обычным компонентом нормальной микрофлоры слизистых путей и на фоне описанных изменений, наряду с другими этиологическими агентами, участвует в возникновении пневмоний у поросят данной возрастной группы и ряде случаев это сопровождается развитием септической стадии с поражением серозных оболочек, суставов и головного мозга.
2.1.5.Обоснование критериев отбора материала для бактериологического исследования на актинобациллёзную пневмонию и гемофилёзный полисерозит.
Гемофилёзный полисерозит. Данные о диссеминации возбудителя свидетельствуют о наибольшей частоте его выделения из поражённых серозных оболочек, серозно-фибринозного экссудата. Выделение чистой культуры возбудителя наиболее вероятно при исследовании пунктата из поражённых суставов и перикарда. В замороженном патологическом материале H.parasuis сохраняет жизнеспособность до 30 суток (режим хранения -18°С).
Актинобациллёзная плевропневмония. Независимо от характера течения болезни возбудитель закономерно обнаруживается в поражённой ткани лёгких и регионарных лимфатических узлах, что определяет характер материала, отбираемого для бактериологического исследования. В патологическом материале, заключённом в водно-глицериновую смесь ( температура хранения 4 --6°С), возбудитель сохраняет жизнеспособность в течение 15 суток, в замороженном тканевом материале – до 45 суток.
2.1.6. Серологическаяидентификация культур H.parasuis A.pleuropneumoniae.
2.1.6.1. Методы и результаты серологической идентификации культур H.parasuis.
Использовали кроличьи гипериммунные сыворотки против типовых штаммов сероваров А, В, С, Д.
Дифференциация сероваров H.parasuis в пробирочной РА показала её малую специфичность. Более эффективной для указанной цели оказалась РСК с растворимыми антигенами.
Исследование в РСК с типовыми сыворотками 46 эпизоотических культур H.parasuis, выделенных при генерализованных серозитах, позволило 47,82% культур отнести к известным сероварам Бакоса. Штаммы серовара А составили 15,2%, В - 17,39%, С - 2,17%, Д-13,04%. В группе штаммов, выделенных из лёгких при пневмониях (18шт), культуры серовара А составили 16,6%, В - 11,1%, С - 5,56%, Д -33,3%, нетипируемые -33,3%. В числе культур, выделенных из носовой слизи клинически здоровых свиней (14 шт.), 35,7% отнесены к серовару А, 14,2% -- к серовару Д, не удалось типировать 50% штаммов.
В целом по всей группе из 78 штаммов H.parasuis было отнесено к серовару А - 19,23%, В - 12,82%, С - 2,56%, Д - 17,95%, нетипируемые культуры составили 47,44%.
Исследование нетипируемых культур в РСК свиноводства атисыворотками против изоляторов этой же категории показало наличие ещё трёх серологических вариантов и часть культур осталась за пределами этих групп. Полученные данные позволяют заключить, что необходимо расширение числа сероваров на базе схемы Бакоса, либо требуется создание новой схемы серовариантной дифференциации с новыми типовыми штаммами.
Анализ серотиповой структуры культур, выделенных в пределах одного хозяйства показал ассоциацию с генерализованными серозитами свиней H.parasuis различной серовариантной принадлежности.
2.1.6.2. Методы и результаты серологической идентификации культур A.pleuropneumoniae.
Для серовариантной дифференциации культур A.pleuropneumoniae испытывали РА пробирочную, РА с 2-МЭ, РА на стекле, РНГА, РНГА с 2-МЭ, РКА пробирочную на стекле, двухступенчатую РИФ. При внутривидовой дифференциации в различных серологических реакциях типовых культур A.pleuropneumoniae (серовары 1,2,3,4,5,6,7,8, 10,12) установлены перекрёстные реакции между сероварами 3,6 и 8, 2 и 3, 1 и 2, 4 и 7. Исследование двухсторонних антигенных связей в большинстве случаев позволяет определить серовариантную принадлежность культур. Из группы ускоренных серологических реакций для серологической идентификации наиболее перспективна РКА с растворимыми антигенами.
При серологической идентификации 82 эпизоотических НАД--зависимых культур бактерий, выделенных при фиброзно-геморрагических пневмониях свиней и классифицированных как A.pleuropneumoniae отнесены к серовару 2 -12,9%, 3 -14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактериям «малой группы» -7,31%. Большую группу штаммов серологически идентифицировать не удалось. Культуры последней группы имели антигенное родство с сероварами 3,6,8,10, но при исследовании в перекрёстной РА с адсорбцией были не идентичны им.
2.1.7. Результаты изучения широты распространения сероваров A.pleuropneumoniae на основании серологических исследований.
Была предпринята попытка дать оценку циркуляции различных сероваров A.pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах одной из областей центральной России по результатам серологических исследований. В РНГА исследовали 639 сывороток крови свиней из десяти хозяйств. Установлено преобладание антител к сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактериологическом исследовании в данном регионе культур сероваров 1 и 12 не выделяли. Причины такой ситуации требуют дальнейшего изучения. В сыворотках крови некоторых серопозитивных свиней удалось выявить нейтрализующие антитела к гемолизинам A.pleuropneumoniae, что свидетельствует о наличии определённого иммунитета к A.pleuropneumoniae.
2.1.8. Разработка и апробация ускоренных серологических методов обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae в патологическом материале.
Для обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae непосредственно в тканевом материале были испытаны реакции коагглютинации (РКА) и двухступенчатой иммунофлуоресценции (РИФ).
Опыты показали, что РКА может быть использована для видовой и серотиповой идентификации A.pleuropneumoniae. Серотиповую специфичность результатов РКА удаётся повысить путём уменьшения дозы сыворотки для сенсибилизации носителя и использования в реакции растворимых капсульных антигенов. Более активные видовые диагностикумы удалось сконструировать при использовании поливалентных сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных не моноантигенами, а смесью антигенов A.pleuropneumoniae различных сероваров. Использование РКА как метода видовой идентификации потребовало выяснения межвидовых антигенных связей A.pleuropneumoniae. Изучали антигенное родство данного вида бактерий с A.suis, A.lignieresii, P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (A,B,C,Д), B.bronchiseptica, S.cholerasuis, S.tiphimurium. Наиболее выраженное антигенное родство установлено с A.suis и A.lignieresii, наличие которых в исследуемом материале может обусловить ложноположительные результаты РКА.
Серовариантную дифференциацию типовых культур A.pleuropneumoniae проводили в РИФ с предельными разведениями антисывороток первой ступени, обеспечивающими свечение клеток свиноводства гомологичными реагентами на четыре креста. Обнаружили перекрёстные реакции сероваров 1 и 2, 2,3 и 6, 3,2,6 и 8, 4 и 7, 10 и 12. Таким образом, надёжной серовариантной дифференциации в ряде случаев добиться не удалось. Слабые перекрёстные реакции интенсивностью на два креста получены с культурами A.suis, A.lignieresii. Не отмечено перекрёстных реакций с P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (А,В,С,Д), E.coll, S.cholerasuis и S.tiphimurium.
При изучении специфичности РКА как метода обнаружения антигенов возбудителя в органах и тканях исследовали супернатанты тканевых (лёгочных) гомогенатов клинически здоровых свиней, морских свинок и получили неспецифические замедленные положительные реакции. Для устранения неспецифической аглютинации стафилококковые антительные диагностикумы дополнительно обрабатывали нормальной кроличьей сывороткой, увеличивали концентрацию альбумина в диагностикуме, прогревали исследуемый материал при 100°С (10,60 мин.) 120°С (15 мин.). Эффективной оказалась термическая обработка материала. Необходимость прогревания исследуемого материала заставила рассмотреть влияние этого фактора на антигены возбудителя. Известно, что клетки A.pleuropneumoniae содержат специфические термостабильные и – лабильные антигены (K.Mittal et al., 1987). Изучение этого вопроса показало, что по термостабильности антигенов культуры можно подразделить на группу термоустойчивых (сер.2,3,6,8,10) и термолабильных (сер.1,7, штамм 202). У культур последней группы при кипячении (60 мин.) снижалась активность антигенов в серологических реакциях, особенно антигенов серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогревание антигенов A.pleuropneumoniae при 100°С в течении 10 минут на серологической активности антигенов возбудителя, кроме серовара 1 не сказывается.