По четырем исследуемым признакам (диаметр, толщина стенки, наличие антеридия и форма оогония) в образцах 1999 г. выявили 40 морфологических типов ооспор. Среди них выявлено две большие группы. Первая представлена ооспорами типичной морфологии. Их диаметр (21 – 40 мкм) и форма (тяготеющая к шаровидной) были близки к типовым показателям (рис. 3). Вторая представлена ооспорами нетипичной морфологии (рис. 4). Их размер (15 – 20 мкм или 41 – 55 мкм) или форма (уклоняющаяся от шаровидной) отличались от характеристик ооспор типичной морфологии.
Анализы морфологии обнаруженных ооспор и соотношения типов спаривания мицелиев, их образующих, показали, что около 61% (от 31% до 83%) всех обнаруженных ооспор в 1999 г. имели негибридное происхождение. Доля гибридных ооспор составила лишь 2% (от 0% до 7%). Происхождение остальных ооспор было спорным. Совместное присутствие А1 и А2 в образцах не всегда приводило к образованию в них ооспор.
Добавление фунгицида Ридомил в среду оказывало сильный угнетающий эффект на образование гибридных ооспор.
Определение жизнеспособности ооспор P. infestans до и после перезимовки показало, что после перезимовки большинство ооспор (от 50% и выше) сохранили свою жизнеспособность (табл. 5).
Таблица 5. Количество жизнеспособных ооспор от скрещивания изолятов А1 и А2 на ржано-томатном агаре и в плодах томата, определенная на основе плазмолизного теста, до и после перезимовки
| Годы | Количество жизнеспособных ооспор, % | |||
| от скрещивания изолятов А1 и А2 на ржано-томатном агаре | в плодах томата | |||
| до перезимовки | после перезимовки | до перезимовки | после перезимовки | |
| 2004–2005 | 60–70 | 60–80 | 80–90 | 60–85 |
| 2005–2006 | 57–70 | 32–44 | 90–100 | 28–50 |
| 2006–2007 | 90–95 | 69–90 | 52–94 | 69–90 |
Изучение прорастания ооспор дало следующие результаты.
За месяц инкубации скрещенных изолятов с примесью триходермы в районе скрещивания образовалось много нетипичных ооспор, до 80% которых прорастало короткой ростковой трубкой. Типичные ооспоры почти не прорастали.
Ооспоры от скрещиваний А1 и А2 на ржано-томатной среде и после перезимовки прорастали ростковой трубкой с частотой от 20 до 35%. Природные ооспоры из плодов томата прорастали с частотой, не превышающей 3%.
Дополнительный тест показал, что наибольшее влияние на прорастание типичных ооспор оказала обработка суспензией из мицелия и спор триходермы. Действие отрицательной температуры также усиливало прорастание ооспор.
Инокуляция суспензией ооспор ломтиков картофеля во влажных камерах не привело к их заражению. Нанесение ооспор на прорастающие клубни не привело к заражению выросших растений.
При заражении проростков томата установили, что они могут поражаться фитофторозом через почву, в которой содержатся ооспоры (или зооспорангии) P. infestans в условиях, ослабляющих иммунитет растения. Однако более вероятно, что при этом проростки поражаются комплексом болезней по типу корневых гнилей, поражающих зародышевый корешок и гипокотиль. Фитофтороз входит в этот комплекс.
В полевом эксперименте, при нанесении суспензии ооспор на семенные клубни, массового поражения растений не обнаруживали. Исключением был очаг на сорте Дельфин (Лаборатория защиты растений РГАУ-МСХА, 2006 г.).
Обсуждение результатов. Максимальное количество ооспор мы наблюдали в плодах томата. Справедливо утверждение, впервые сформулированное С.А. Кузнецовым, что в условиях Московской области плоды томата – это своеобразная «маленькая Мексика» (Смирнов, Кузнецов, 2005; Smirnovetal., 2008; Smirnov, Kuznetsov, 2009).
Мы полагаем, что в большинстве современных полевых популяций P. infestans могут образовываться ооспоры всех трех типов по происхождению. Тип образуемых ооспор может в значительной степени регулироваться внешними факторами и условиями существования полевых популяций патогена (Turkensteenetal., 2000). Инфекционный цикл P. infestans включает в себя несколько стратегий (Дьяков, 1992; 1998). Зооспоры и зооспорангии соответствуют r‑стратегии (размножение, низкая сопротивляемость), гибридные ооспоры – К-стратегии (жизнеспособность, высокая сопротивляемость) (Дьяков, 1992). Ооспоры от самооплодотворения и партеногенетические ооспоры соответствуют промежуточным стратегиям. Первые ближе к К-стратегии, вторые находятся между r- и К-стратегиями (Смирнов, 2003а).
Проведенные нами лабораторные и полевые эксперименты стали еще одним косвенным подтверждением того, что гибридные ооспоры могут иметь значительное инфекционное значение, которое, однако, может реализовываться не сразу, а в последующих вегетационных сезонах. Прямое исчерпывающее доказательство этого с использованием молекулярно-генетических маркеров RFLP получено в Голландии в начале 1990‑ых годов (Drenthetal., 1994).
Образование гибридных ооспор возможно только у жизнеспособных полевых популяций патогена. Самооплодотворение в бесполых полевых популяциях может быть этапом к гибридизации и со временем привести к кардинальным изменениям в генетической структуре полевых популяциях патогена. Вклад партеногенетических ооспор, на наш взгляд, в последние годы недооценивается. В определенных условиях (нежестких) именно партеногенетические ооспоры могут иметь существенное эпидемиологическое значение – вызывать ранние эпифитотии. Особенно это может быть актуально для томата, если такие ооспоры попадут как примесь на поверхность семенной кожуры семян.
Стратегии размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans
Соотношение бесполого и полового размножения имеет принципиальное значение в эволюции жизненных стратегий у грибов и псевдогрибов. Функцию размножения и распространения они осуществляют в бесполой фазе.
В этой связи, у P. infestans целесообразно определять и исследовать компоненты долгосрочной и краткосрочной жизнеспособности (рис. 5). Долгосрочная жизнеспособность в природных условиях напрямую определяется половой стадией патогена, краткосрочная – в основном его агрессивностью. Агрессивность увеличивает общий потенциал патогена, но ослабляют его K‑потенции (Дьяков, 1992). При проявлении агрессивности на определенных сортах в последние годы выявлена некоторая специфичность (Маторина, личное сообщение; Flieretal., 2002; Макаров и др., 2003; Филиппов и др., 2004).
В основе нашего метода лежит единовременное определение встречаемости ооспор и зооспорангиев в тканях картофеля и томата.
Каждая популяция, каждый штамм P. infestans может характеризоваться определенной агрессивностью. Однако в природе проявление агрессивности специфично корректируется рядом факторов – устойчивостью сортов и климатическими условиями (Youngetal., 2004). На восприимчивых сортах при благоприятных для фитофтороза условиях проявление агрессивности P. infestans будет максимальным. На сортах с полевой устойчивостью проявление агрессивности будет сдерживаться (Carlisleetal., 2002; Pillet, 2003; Montarryetal., 2006; Flieretal., 2007).
Наконец, мы исходили из того, что все показатели должны выражаться в баллах, соответствующих определенному рангу. Согласно закону Вебера-Фехнера, ранговая оценка показателей болезни позволит избежать субъективных ошибок (Forbes, Korva, 1994).
Материалы и методы. Использованы те же материалы, как в гл. 6. Обесцвечивание листьев и плодов томата проводили по методике А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (Смирнов, Кузнецов, 2006). Обесцвеченные в 96% кипящем растворе этанола и 10% водного растворе хлорсодержащего средства образцы микроскопируют. При малом увеличении (около х150) проверяют 50 случайных полей зрения, каждое – примерно 1 мм2. При поиске ооспор просматривают 50 полей зрения в тканях образца. При поиске зооспорангиев просматривают 25 полей зрения в тканях образца и 25 полей зрения – в свободном растворе. Если число обнаруженных ооспор или зооспорангиев не превышает 25, находится в интервале от 26 до 250, или превышает 250, то их встречаемость оценивают как редкую, умеренную или частую соответственно.
Далее подсчитывают индексы встречаемости зооспорангиев (ИЗ) и ооспор (ИО) в полевой популяции по формулам: ИЗ = 0,05·РС + 0,5·УС + ЧС, ИО = 0,05·РО + 0,5·УО + ЧO, где: РС – частота встречаемости образцов с редкими зооспорангиями, УС – частота встречаемости образцов с умеренными зооспорангиями, ЧС – частота встречаемости образцов с частыми зооспорангиями, РО – частота встречаемости образцов с редкими ооспорами, УО – частота встречаемости образцов с умеренными ооспорами, ЧО – частота встречаемости образцов с частыми ооспорами, %.
На основе предшествующего кластерного анализа (Смирнов, Кузнецов, 2001) распределения индексов можно выделить 4 основных стратегии размножения (рис. 6, 7): С – слабая, Б –бесполая, П –половая, и Д – двойная.
Распространенность болезни (Р) и индекс развития болезни (И) определяются по стандартным формулам (Попкова, Быченкова, 1969, с изменениями) (Практикум…, 1976): Р = n·100% / N; И = å(ai·bi) 100% / 5N, где n – число больных растений, aibi – сумма произведений числа больных растений (ai) на соответствующий им балл интенсивности поражения (bi): [наименьший балл – 0 (отсутствие поражения), 1 – 0,1–10% растения поражено, 2 – 11–25% поражено, 3 – 26–50% поражено, 4 – 51–89% поражено, 5 (наибольший) – 90–100% растения поражено], N – общее число больных и здоровых растений.
Индекс агрессивности (ИА) полевой популяции P. infestansможно подсчитать так: ИА = (Р · И · ИЗ) / 10 000. ИАаналогиченпоказателюCFI (Composite Fitness Index) (Tooley et al., 1986; Kadish, Cohen, 1988).
Индекс ИО характеризует способность полевой популяции формировать потенциал первичной инфекции непосредственно insitu, который следует отслеживать для предотвращения раннего развития фитофтороза (Evenhuisetal., 2007). Наибольшую интенсивность образования ооспор следует ожидать при промежуточном развитии заболевания, когда достаточно живой питающей ткани, достигаются высокие жизнеспособность мицелиев и вероятность контакта между А1 и А2. Наименьшую интенсивность образования