Существуют достаточно надежные способы количественной регистрации воздействия загрязнителей, например, плазмолиз. Для определения количества погибших клеток пользуются методом витального окрашивания. Живые клетки сильно ограничивают проникновение в протоплазму органических веществ, и, будучи помещенными в раствор ряда красителей, практически не окрашиваются. В мертвые клетки краска проникает свободно, благодаря чему наличие погибших клеток легко поддается учету.
Метод индукции флюоресценции хлорофилла позволил исследовать активность фотосинтетического аппарата у ряда растений при изменении внешних условий среды. Эта особенность хлорофилла была предложена в качестве индикаторного признака нарушений, вызванных воздействием поллютантов [48].
Лишайники являются надежными индикаторами загрязнения воздуха и традиционно используются для целей биоиндикации. Лихенодиагностика позволяет осуществлять картирование территории по степени загрязненности атмосферного воздуха. Однако возможности лихеноиндикации ограничены чувствительностью нативных видов, поскольку многие лишайники, аккумулируя загрязнитель из атмосферы при его хроническом воздействии, гибнут от низких концентраций, зачастую не достигающих установленнных для человека и теплокровных животных нормативов.
Для биотестирования отработано немало методов на различных культурах: белой горчице (Sinapis alba L.), озимой и яровой пшенице (Triticum aestivum L.), овсе (Avena L.), гречихе (Fagopyrum L.), огурце (Cucumis L.), кресс-салате (Lepidium sativum L.), сое (Glycine L.), льне (Linum L.), еже сборной (Dactylis glomerata L.).
На горчице учитывают степень ингибирования первичного корешка проростка после обработки семян противодвудольным гербицидом. Определяют также увядание растений, торможение прироста листьев надземной массы проростков.
Овес и рис используют как индикаторы почвенных противозлаковых гербицидов, так как это наиболее чувствительные виды среди злаковых культур. При этом основным тестом является ингибирование роста зародышевого корня и листа.
Редис является традиционным биотестом при исследовании остатков пестицидов в почве и конечной продукции растениеводства, т. к. обладает по сравнению с другими объектами наиболее высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры.
На огурце и гречихе тестируют гербициды – производные мочевины и фенилкарбаматы. При этом у огурца учитывают рост первичного корня, у гречихи – утолщение стебля, деформацию зародышевых листьев, а также торможение роста. Кресс-салат используется как тест-объект для оценки загрязнения воздуха и почвы. Тест длится 10 дней. При наличии вредных веществ снижается процент всхожести и ингибируется рост зародышевых корешков.
Видимо, успешное решение проблем биоиндикации во многом будет определяться подбором, а иногда и направленным созданием сортов (линий) культурных растений, чувствительных к загрязнению. К сожалению, в настоящее время подобные сорта и линии отсутствуют. Поэтому усилия исследователей должны быть направлены на поиск перспективных форм и работу с ними [44].
2. Объект, программа и методика исследований
Объектом исследований являлись проростки озимого тритикале сорта «Михась».
Выбор данного сорта в качестве объекта исследований был связан с тем, что данный сорт является стандартом, районированным по всей республике. Из 350–400 тыс. га посевных площадей отводимых ежегодно под озимое тритикале до 56% занято посевами этого сорта.
Предметом наших исследований являлось изучение влияния глифосатсодержащего гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале и на содержание в них хлорофилла.
Выбор препарата «Раундап» для изучения его влияния на развитие проростков озимого тритикале, был основан на том, что согласно отраслевому регламенту возделывания озимого тритикале (ОР МСХП РБ 0215–2005) данный гербицид может применяться на полях, предназначенных под посев тритикале после уборки предшественника по вегетирующим многолетним сорнякам. Учитывая, что период полураспада глифосата составляет от 3 до 141 дня, нами была выдвинуто предположение о возможности влияния остаточных количеств данного гербицида на развитие проростков исследуемой культуры. На основании этого и была составлена программа исследований.
В программу исследований входили следующие вопросы:
– Изучение влияния исследуемого гербицида на лабораторную всхожесть семян.
– Изучение влияния раундапа на развитие проростков.
– Изучение влияния раундапа на содержание в вегетативной массе проростков хлорофилла.
– Изучение влияния глифосатсодержащего гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале в динамике.
Методика исследований
Для проведения исследований были отобраны относительно одинаковые по размеру неповрежденные семена озимого тритикале. Масса 1000 семян составляла 49,5 грамм. Семена (по 100 шт.) помещались в пластиковые контейнеры-растильни размером 150х150х110 мм. На дне контейнера находился слой стерильной ваты толщиной 0,5 см покрытый сверху фильтровальной бумагой. В каждый контейнер было внесено по 70 мл водной вытяжки из почвы. В почвенные вытяжки вносили гербицид «Раундап» в следующих концентрациях по действующему веществу: 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0; 100,0; 150,0; 200,0; 250,0; 300,0; 350,0; 400,0; 450,0; 500,0; 550,0; 600,0; 650,0; 700,0; 750,0; 800,0; 850,0; 900,0; 950,0; 1000,0 мкг/л.
Через 7 дней определяли лабораторную всхожесть семян. После определения всхожести ростки отделяли от корешков и зерновки и проводили их взвешивание на аналитических весах ВЛР-200. Далее производили измерение длины ростков, а затем их высушивали до воздушно-сухого состояния и повторно взвешивали.
Весовой коэффициент определяли как отношение суммарной сырой массы проростков к их суммарной длине (мг/мм).
Экстракцию хлорофилла проводили 96%-м этанолом. Для экстрагирования отбирали по 100 мг сухих проростков, измельчали их с кварцевым песком в присутствии карбоната кальция. Полученную массу количественно переносили в бюксу с 20 мл этилового спирта. Через 24 часа проводили вакуумную фильтрацию вытяжки, а затем доводили ее объем до 50 мл. Оптическую плотность спиртовой вытяжки хлорофилла определяли на спектрофотометре «Solar PV 1251C» при l = 649 и 665 нм. Количество хлорофилла рассчитывали по формулам:
CХл а = 13,70´D665 – 5,76´D649
CХл в = 25,80´D649 – 7,60´D665 [49].
Статистическая обработка результатов исследований проводилась при помощи табличного редактора Excel и пакета статистического анализа STATISTICA 6.0 с использованием практического руководства Ю.М. Жученко [50].
В эксперименте по изучению влияния раундапа на проростки озимого тритикале в динамике, нами использовались следующие концентрации гербицида в почвенной вытяжке: 0,05; 0,25 и 0,50 мг/л.
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Влияние микроконцентраций гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале
На первом этапе наших исследований (2006–2007 гг.) было установлено, что препарат гербицидной активности «Раундап» оказывает некоторое влияние на энергию прорастания и лабораторную всхожесть семян озимого тритикале, но нам не удалось установить закономерности в этом влиянии. Были проведены эксперименты, в которых увеличили число повторностей и использовали большее разнообразие концентраций пестицида.
Результаты наших исследований по влиянию гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Влияние гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале
| Концентрация гербицида в питательной среде, мкг/л | Всхожесть | |
| в процентах | относительная (контроль 100%) | |
| 1 | 2 | 3 |
| Контроль (без гербицида) | 95 | 100,0 |
| 5,0 | 92 | 96,8 |
| 12,5 | 90 | 94,7 |
| 25,0 | 94 | 98,9 |
| 37,5 | 90 | 94,7 |
| 50,0 | 92 | 96,8 |
| 100,0 | 90 | 94,7 |
| 150,0 | 88 | 92,6 |
| 200,0 | 87 | 91,6 |
| 250,0 | 88 | 92,6 |
| 300,0 | 88 | 92,6 |
| 350,0 | 90 | 94,7 |
| 400,0 | 90 | 94,7 |
| 450,0 | 93 | 97,9 |
| 500,0 | 87 | 91,6 |
| 550,0 | 91 | 95,8 |
| 600,0 | 94 | 98,9 |
| 650,0 | 93 | 97,9 |
| 700,0 | 90 | 94,7 |
| 750,0 | 92 | 96,8 |
| 800,0 | 88 | 92,6 |
| 1 | 2 | 3 |
| 850,0 | 87 | 91,6 |
| 900,0 | 89 | 93,7 |
| 950,0 | 86 | 90,5 |
| 1000,0 | 93 | 97,9 |
Как видно из представленных данных, между всхожестью семян озимого тритикале и концентрацией изучаемого препарата зависимости не установлено (коэффициент корреляции r = – 0,21 при уровне значимости р = 0,31). Во всех случаях всхожесть семян культуры ниже контрольной, но не снижается более чем на 10%.
Таким образом, нами было установлено, что препарат гербицидной активности «Раундап» в микроконцентрациях оказывает незначительное влияние на начальные этапы развития проростков озимого тритикале сорта «Михась», тогда как в литературных источниках указывается отсутствие влияния данного гербицида на всхожесть семян культурных растений.
3.2 Влияние гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале
Влияние раундапа на развитие проростков оценивалась по следующим показателям: сырая масса проростков, воздушно-сухая масса проростков, содержание воды в проростках, средняя длина проростков и весовой коэффициент развития проростков. Результаты наших исследований по влиянию гербицида на накопление вегетативной массы представлены в табл. 2.