Наряду с молекулярным азотом бактерии рода Clostridium хорошо усваивают минеральные и органические азотсодержащие соединения. В качестве источника углеродного питания бактерии рода Clostridium используют различные соединения, которые обычно одновременно служат для них и источником энергии. К фосфору, калию и кальцию они значительно менее чувствительны, чем азотобактер. Однако удобрение почв фосфорно-калийными солями, известкование почв или компостов всегда приводит к возрастанию численности. Клостридии относительно устойчивы к кислой и щелочной реакции среды. Область рН, при которой их развитие протекает нормально, довольно широка; минимальное значение рН ниже 4,5, максимальное — выше 8,5. Влияние воздушно-водного режима на развитие бактерий рода Clostridium изучено достаточно полно. Будучи анаэробными, они хорошо переносят высокое насыщение почвы влагой. Однако оптимальная степень увлажнения для них определяется типом почвы и обеспеченностью органическим веществом. Лучше всего клостридий развивается при влажности почвы, равной 60—80% от полной влагоемкости.
Clostridium — анаэробный организм, т.е. может развиваться только в бескислородной среде. Но в почве он живет в симбиозе с двумя другими бактериями, образуя вместе с ними слизистые комки, напоминающие кефирные зерна. Эти спутники сами не способны усваивать свободный азот, но они поглощают кислород и тем защищают клостридий от вредного влияния этого газа. В симбиозе с ними Cl. Pasteurianum может развиваться во всякой почве, какова бы ни была степень ее аэрации, и обогащает ее связанным азотом. Микроб производит при этом брожение сахара и на каждые 1000 частей его усваивает 1,5—3 части азота. Так как почвы относительно богаты углеродистыми соединениями и бедны азотом, то деятельность этого микроба представляется в высокой степени плодотворною.
в) Значение других видов микроорганизмов в пополнении азота в почве
К семейству Azotobakteriaceae относят и азотфиксирующих бактерий рода Azomonas – A.agilis, A.insignis и A. macrocytogens. Первые два вида обитают в водоемах, третий – в почвах. Виды Azonomas близки к азотобактеру, отличаются от него рядом морфологических и физиологических особенностей. Для A.agilis характерны относительно крупные, овальные клетки с перитрихальным жгутикованием, для A.insignis также крупные, но более округлые клетки, с полярными или лофотрихальными жгутиками, для A.makrocytogenes – клетки размером 8 – 10 мкм с одним полярным жгутиком. Образуют колонии с розоватым пигментом, который флуоресцирует в ультрафиолетовых лучах. Предстваители рода Azonomas – аэробы. В отличие от азотобактера они могут расти и фиксировать азот при рН 4,6 – 6,9 и даже 4,3. Источник углерода для этих бактерий – углеводы, спирты, органические кислоты. Достаточно эффективно виды Azonomas связывают азот атмосферы (до 15 – 18 мг N2 на 1г использованного сахара). Распространены в тропических почвах. К этому же семейству относятся и бактерии рода Beijerinckia, близкие по свойствам к азотобактеру. От азотобактера они отличаются значительной кислотоустойчивостью, кальцифобностью и некоторыми другими свойствами. Они могут расти и фиксировать азот даже в среде с рН 3,9. Большинство культур бактерий рода Beijerinckia формируют на безазотистой среде с глюкозой выпуклые, блестящие, нередко складчатые слизистые колонии вязкой консистенции. В отличие от азотобактера эти бактерии не усваивают ароматические соединения и хуже ассимилируют органические кислоты. При развитии на среде с углеводами накапливаются кислые продукты (уксусная и другие органические кислоты). Они менее требовательны по сравнению с азотобактером к концентрации фосфорных соединений в среде. Даже небольшие дозы соединений кальция тормозят рост представителей данного рода. Они значительно менее, чем азотобактер, чувствительны к повышенной концентрации солей железа и алюминия, нуждаются в молибдене, но также довольствуются меньшими его дозами. Эти свободноживущие азотфиксаторы фиксируют 18 – 20 мг азота на 1 г использованного сахара. К свободноживущим фиксаторам молекулярного азота семейства Azotobakteriaceae относятся также виды рода Derxia, выделенные из почв Индии с рН 6,5. Это медленно растущие на безазотистых средах палочковидные бактерии со слизистыми капсулами, обладающие на определенной стадии развития жгутиками. Колонии могут быть пленочными или слизистыми, при старении преобретают желтовато-коричневый цвет. Derxia используют различные источники углерода – моно-, ди-, полисахариды, спирты, органические кислоты, в среде без азота фиксируют 12 – 15 мг N2 на 1 г использованного сахара. Представитель данного рода – Derxia gummosa – развивается в почвах с рН 4,5 – 6,5, однако лучше растет при рН 5,1 – 5,5. Виды данного рода распространены в почвах тропической зоны – Индии, Индонезии, тропической Африки, Южной Америки.
В результате применения новых методов было установлено, что функция фиксации молекулярного азота присуща и многим другим микроорганизмам: фототрофным бактериям, цианобактериям, хемолитоавтотрофным бактериям, метилотрофным, сульфатвосстанавливающим, метаногенам и др. Известно уже более ста видов микроорганизмов, обладающих способностью к фиксации азота атмосферы. Суммарная деятельность свободноживущих бактерий в природных субстратах, в частности в почвах, приводит к накоплению азота. Так, в пахотные почвы зоны умеренного климата за счет свободноживущих азотфиксаторов ежегодно поступает от 26 до 86 кг/га азота в год, в почвы тропической зоны – до 100 и более. Считают, что в среднем в пахотных почвах России свободноживущие азотфиксаторы связывают до 20 кг/га азота в год.
3. Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы: значение клубеньковых бактерий в агротехнике бобовых культур
Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы выделены М.Бейеринком в 1888 г. из корней клубеньков (бородавчатых наростов) бобовых растений. Микроорганизмы назвали клубеньковыми бактериями, и было установлено, что они вызывают образование клубеньков, в которых осуществляется фиксация азота атмосферы. Бактерии в клубеньках питаются органическими соединениями, синтезированными растением, а растение получает из клубеньков связанные соединения азота. Так, между бактериями и растениями устанавливаются симбиотические взаимоотношения. Способность клубеньковых бактерий (Rhizobium) фиксировать атмосферный азот в симбиозе с бобовыми растениями чрезвычайно важна в практике растениеводства и земледелия. Долгое время бобово-ризобиальный симбиоз рассматривали как особенность клубеньковых бактерий проникать в корни бобовых, образовывать клубеньки и улучшать рост бобового растения за счет симбиотической азотфиксации.
Для клубеньковых бактерий характерно поразительное разнообразие форм — полиморфность. На это обращали внимание многие исследователи, изучая клубеньковые бактерии в чистой культуре в лабораторных условиях и почве. Клубеньковые бактерии могут быть палочковидными и овальными. Среди этих бактерий встречаются также фильтрующиеся формы, L-формы, кокковидные неподвижные и подвижные организмы. Молодые клубеньковые бактерии в чистой культуре на питательных средах обычно имеют палочковидную форму, размер палочек примерно 0,5—0,9 X 1,2—3,0 мкм, подвижные, размножаются делением. У палочковидных клеток клубеньковых бактерий клевера наблюдается деление перешнуровыванием. С возрастом палочковидные клетки могут переходить к почкованию. На питательных средах клубеньковые бактерии различных видов бобовых растений растут с разной скоростью. К быстрорастущим относятся клубеньковые бактерии гороха, клевера, люцерны, кормовых бобов, вики, чечевицы, чины, донника, пажитника, фасоли, нута; к медленнорастущим — клубеньковые бактерии люпина, сои, арахиса, сераделлы, маша, вигны, эспарцета, дрока. Вполне сформировавшиеся колонии быстрорастущих культур можно получить на 3-4-е сутки инкубации, колонии медленнорастущих — на 7 - 8-е. Для быстрорастущих клубеньковых бактерий характерно перитрихиальное расположение жгутиков, для медленнорастущих — монотрихиальное. В качестве источника углерода в питательных средах клубеньковые бактерии используют углеводы и органические кислоты, в качестве источника азота — разнообразные минеральные и органические азотсодержащие соединения. При культивировании на средах с высоким содержанием азотсодержащих веществ клубеньковые бактерии могут утратить способность проникать в растение и образовывать клубеньки. Поэтому обычно клубеньковые бактерии выращивают на растительных экстрактах (фасолевом, гороховом отваре) или почвенных вытяжках. Необходимый для развития фосфор клубеньковые бактерии могут получать из минеральных и органических фосфорсодержащих соединений; источником кальция, калия и других минеральных элементов могут служить минеральные соединения. Для развития большинства культур клубеньковых бактерий требуется оптимальная температура в пределах 24—26°. При 0° и 37°С рост приостанавливается. Обычно культуры клубеньковых бактерий в условиях лаборатории хранят при пониженных температурах (2—4 °С). Влажность почвы для образования клубеньковых бактерий должна быть в интервале 40-80% от полной влагоемкости. рН почвы лучше всего 6-7, за пределами рН 3,5-11,5 рост их приостанавливается.
Видовая специфичность клубеньковых бактерий.
Клубеньковые бактерии формируют симбиотические ассоциации с бобовыми растениями семейства Leguminosae, в котором выделяют три подсемейства – Mimosoideae, Papillonoideae и Caesalpinoideae. До 90% видов первого и второго подсемейств и 23% видов третьего способны вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями. Клубеньковые бактерии характеризуются видовой специфичностью (избирательностью) по отношению к растению – хозяину. Определенный вид бактерий обычно образует клубеньки только на одном или нескольких видах бобовых растений. Так, Rhizobium leguminosarum инфицирует горох, вику, кормовые бобы, чину и чечевицу; Rhizobium phaseoli – фасоль; Rhizobium japonicum – сою; Rhizobium lupini – люпин, сараделла; Rhizobium vigna – вигну, мак и арахис; Rhizobium cicer – нута; Rhizobium trifolli – клевер; Rhizobium meliloti – люцерна, донник, пажитник; Rhizobium simplex – эспарцета; Rhizobium lotus – лядвенец. Специфичность клубеньковых бактерий возникла в результате их длительного приспособления к одному растению или к группе их и генетической передачи этого свойства. В связи с этим различная приспособленность клубеньковых бактерий к растениям имеется и в пределах группы перекрестного заражения. Так, клубеньковые бактерии люцерны могут образовать клубеньки у донника. Но тем не менее они более приспособлены к люцерне, а бактерии донника — к доннику. В процессе инфекции корневой системы бобовых растений клубеньковыми бактериями большое значение имеет вирулентность микроорганизмов. Если специфичностью определяется спектр действия бактерий, то вирулентность клубеньковых бактерий характеризует активность их действия в пределах данного спектра. Под вирулентностью подразумевается способность клубеньковых бактерий проникать в ткань корня, размножаться там и вызывать образование клубеньков.