Зміст
Вступ
1. ПЛР – основний метод ДНК - діагностики
2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції
3. Переваги ПЛР - діагностики інфекційних захворювань тварин
Висновки
Список використаних джерел
Вступ
Інфекційна патологія у ветеринарії охоплює широке коло хвороб, різних як по характеру течії (гострі, хронічні, латентні), ступені розповсюдження (від спорадичних випадків до епізоотії), так і по складності їх діагностики. Важливе, а при деяких хворобах вирішальне значення мають серологічні дослідження, направлені на виявлення антитіл, що виробляються організмом тварини у відповідь на впровадження інфекційного агента або вакцини. Не дивлячись на ряд переваг, методи, засновані на цьому принципі, володіють недостатньою чутливістю і специфічністю. Істотний прорив був зроблений останніми роками, коли для діагностичних цілей привернули методи генної інженерії і біотехнології. Для діагностики інфекційних захворювань найбільшого застосування знайшов спосіб ампліфікації (множення) нуклеїнових кислот: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), лігазна ланцюгова реакція, NASBA-метод та ін [1].
Метою даної роботи було виявити основні переваги і ефективність методу ДНК-діагностики, а також впровадження його в систему державної ветеринарної служби.
У роботі були поставлені наступні завдання:
- дати комплексну оцінку методу ПЛР-діагностики;
- визначити переваги ПЛР-діагностики інфекційних захворювань;
- розглянути деякі види патологій тварин, при яких цей метод грає важливу роль.
1. ПЛР – основний метод ДНК-діагностики
ПЛР в лабораторній діагностиці інфекцій характеризується швидкістю, неперевершеною чутливістю і високою специфічністю, що дозволяє виявляти мікроорганізми, присутні в дуже низьких концентраціях (1-10 збудників в пробі). При цьому ДНК інфекційних агентів може бути достатньо ефективно екстрагована з будь-якої біологічної рідини або тканини, а також з проб об'єктів навколишнього середовища (грунти, води і так далі) і продуктів харчування. Полімеразна ланцюгова реакція ефективна при виявленні бактерійних, грибкових, паразитарних і вірусних патогенів.
Одним словом, це метод, заснований на принципі ампліфікації, — ізольованого множення гена або його певного фрагмента. Ампліфікація — один із способів виживання мікроорганізмів і клітин тварин в умовах дії протипухлинних і протибактерійних препаратів. ПЛР дозволяє проводити аналогічний процес in vitro, тобто в пробірці.
Основні положення ампліфікації ДНК in vitro були обгрунтовані співробітником корпорації "Cetus" (США) Кері Маллісом в 1983 році. Через 10 років за цю розробку він був удостоєний Нобелівської премії по хімії.
Метод базується на добудові ферментом (термостабільна ДНК-полімераза) олігонуклеотидных затравок (праймерів), приєднаних до денатурованої низькокопійованій ДНК-матриці. Праймери визначають специфічність реакції і величину фрагмента. Процес ампліфікації включає багатократне повторення певних циклів, як правило, 30-40. Кожен складається з трьох основних стадій: денатурація ДНК, відпалу (приєднання) і добудови праймерів.
На першій стадії дволанцюгова ДНК-матриця денатурується при 94°С з утворенням одноланцюгових ДНК. На другій температура знижується до 55-65° С і відбувається приєднання праймерів до кожної з двох одноланцюгових ДНК. На третій фермент (термостабільна ДНК-полімераза) при температурі 72° С добудовує обидва праймери в напрямі від 3-го до 5-го кінця, внаслідок чого утворюється дволанцюгова ДНК.
Після першого циклу створюються довгі фрагменти, оскільки полімераза добудовує праймери, використовуючи як матрицю весь геном. У наступних циклах праймери відпалюють із знов синтезованими молекулами ДНК. Полімераза зупиняється, доходячи до кінця цих молекул, тобто до праймерів, використаних в попередньому циклі. Після кожного циклу число молекул матриці подвоюється, в результаті відбувається експоненціальна ампліфікація фрагмента ДНК-матриці. Це дозволяє за 25-40 циклів накопичити ПЛР-продукт в достатній кількості для візуальної детекції після електрофоретичного розділення і фарбування бромистим етидієм [1].
Основні компоненти ПЛР
1. Два синтетичних олігонуклеотидних праймера (завдовжки приблизно по 18-25 нуклеотидов). Кожен з них комплементарний одному з ланцюгів матриці, що обмежує початок і кінець ампліфікуючої ділянки. Специфічність реакції в основному визначається температурою відпалу праймерів, при якій відбувається їх комплементарна взаємодія з ДНК-матрицею. Температура залежить від довжини праймера і змісту G-C пар (З — гуанин, З — цитозин). Як правило, вона варіюється в діапазоні 50-64° С. Дизайн праймерів здійснюється з використанням спеціальних комп'ютерних програм і автоматичного ДНК-синтезатора.
2. Термостабільна ДНК-полімераза— фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів, — Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woe-sei (Pwo-полімераза) та інші.
3. Дезоксинуклеотідтріфосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
4. Іони Mg2+, необхідні для активації полімерази.
5. Буфер, що створює оптимальні умови для функціонування ферменту. Як правило, використовується Тріс-hci буфер, який утримує рН реакційного середовища в межах 7,8. Для стабілізації ферменту в середовище додають желатин або бичачий сироватковий Альбумін, неіонні детергенти (Твін-20, Тритон Х-100 і ін.) [3].
Створення ампліконів необхідної довжини починається з 3 до 25 циклів і носить експоненціальний характер. Через виснаження дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймери, інактивацій Taq-полімерази, зростання конкуренції ампліконов у ферменті, починаючи з 40-45 циклів реакція виходить на плато. Звідси, як правило, при постановці реакції число циклів не перевищує 30-35.
ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1° С. Зазвичай в нім можна задавати складні програми, зокрема можливість "гарячого старту" (Touchdown ПЛР) і подальше зберігання ампліфікованих молекул при 4° С. Для реакції в реальному часі випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. З тих, що поставляються зарубіжними фірмами найбільш популярні ампліфікатори фірм "Перкин-ельмер", "Еппендорф" і "Хайбенд".
В даний час розроблені вітчизняні прилади: "Цикло-темп", "Медімакс", "Термоцик", "Амрly 4L" та ін.
2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції
Вона складається з трьох основних процедур: пробопідготовки, яка в основному зводиться до виділення ДНК або РНК, постановки ПЛР і детекції ампліфікованого продукту.
Виділення нуклеїнових кислот (ДНК, РНК). Досліджуваним матеріалом для ПЛР можуть слугувати будь-які, навіть гістологічні препарати. Визначення можна проводити, використовуючи як клінічний і патологоанатомічний матеріал, так і проби з об'єктів зовнішнього середовища.
Залежно від виду визначеного збудника і клінічної проби застосовують різні способи виділення ДНК (РНК). В деяких випадках обробка полягає в додаванні агента, що лізирує, містить розчин гуанидинтиоционата, з подальшою сорбцією ДНК (РНК), багатократного відмивання і елюції, очищеної нуклеїнової кислоти.
В інших випадках необхідна депротеїнізація фенолом/хлороформом з подальшим осадженням ДНК (РНК) етанолом або ізопропанолом. Останніми роками ряд вітчизняних фірм ("Літех", "ДНК-технологія", "Діалат" і ін.) проводять набори для екстракції ДНК і РНК з різних клінічних зразків.
Постановка ПЛР. У пробірку типу "Eppendorf" об'ємом 0,2 або 0,5 мл додають певну кількість реакційної суміші, що складається з води, ПЛР-буфера, розчину дизоксинуклеотидтрифосфатов, розчину праймерів і Taq-полимеразы. Потім вводять одну краплю мінерального масла з високою точкою кипіння, наприклад вазелінового, для запобігання випаровуванню реакційної суміші в процесі ампліфікації. Якщо використовувати ампліфікатор з кришкою, що підігрівається, цього робити не потрібно.
Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфата, побічного продукту приєднання нуклеотидтрифосфатов до ланцюга ДНК, що росте, до ортофосфату.
Оброблену клінічну пробу вносять під масло в об'ємі 5-10 мкл. Ампліфікація проводиться в програмованому термостаті в автоматичному режимі за програмою, відповідно виду визначеної інфекції. Як правило, необхідно 1,5-3 години залежно від заданої програми.
При постановці реакції проводиться відповідний контроль: позитивний — препарату ДНК досліджуваного збудника; негативний — деіонізованої води. Останній необхідний для перевірки реакційної суміші на наявність контамінації продуктами ампліфікації (ампліконами).
В одній реакції ампліфікації можливе визначення декількох інфекцій (Multiplex PCR). З цією метою в реакційну суміш додають декілька пар праймерів, проте при цьому зменшується кількість води. Враховуючи, що чутливість реакції знижується пропорційно розбавленню, рекомендується одночасно визначати не більше 3 інфекцій.
Для визначення РНК-вмісних вірусів у складі реакційної суміші додатково вносять зворотну транскриптазу і інгібітор рибонуклеази (RT-PCR).
Ефективність ПЛР залежить від багатьох чинників, зокрема від кількості ДНК-матриці, якості Taq-полимеразы і дезоксинуклеотидтрифосфатів, специфічності праймерів, концентрації Мд2+ і програми ампліфікації. Для отримання максимального ефекту проводять оптимізацію реакції. У таблиці наведені межі варіації її основних параметрів.
Чутливість ПЛР істотно залежить від температури відпалу праймерів. При заниженій підвищується вірогідність ампліфікації неспецифічних фрагментів, при підвищеній знижується вихід ампліфікованого продукту, оскільки праймери слабо взаємодіють з ДНК-матрицею.