| Параметр | Діапазон варіацій | Градієнт варіацій |
| Концентрація Mg2+ | 1,5-3,0 mM | 0,25 mM |
| Кількість Taq-полимеразы в пробірці | 0,5-3,0 ед. | 0,5 ед./100 мкл |
| Концентрація кожного праймера | 0,2-2,0 мкМ | 0,5 мкМ |
| Температура відпалу | 45-64° З | 2-3° З |
Насьогодні розроблений ряд підходів, що підвищують специфічність реакцій. Часто з цією метою застосовується так звана "Nested PCR" (гніздова ПЛР). Принцип даного методу полягає у використанні двох пар праймерів, одна з яких здатна ампліфікувати внутрішню ділянку амплікона, отриманого після першого раунду, із зовнішньою парою праймерів. Застосування гніздової ПЛР має переваги: висока чутливість методики; відсутність необхідності використовувати інші методи. До недоліків відносять перенесення продуктів реакції з однієї пробірки в іншу, що істотно знижує концентрацію інгібіторів, а також приводить до появи великої кількості псевдопозитивних результатів внаслідок перехресної контамінації проб продуктами ампліфікації.
Останніми роками для підвищення чутливості і специфічності реакції використовується "гарячий старт". Суть його полягає в тому, що перш ніж додавати Taq-пoіимеразу, реакційна суміш прогрівається заздалегідь до 95° С. Це виключає можливість утворення неспецифічних фрагментів внаслідок неспецифічного відпалу праймерів при температурі нижче оптимальною.
Механізм простої полімеразної ланцюгової реакції непридатний для ідентифікації рибонуклеїнових кислот (РНК), оскільки Taq-noлимераза нездатна каталізувати синтез ДНК на матриці РНК. Разом з тим добре відомо, що геноми багатьох вірусів складаються з молекул рибонуклеїнових кислот (РНК), і внаслідок цього актуальна ідентифікація РНК-вірусів. Практично це вирішується за допомогою декількох прийомів, зокрема використання додаткового ферменту — РНК-залежної ДНК-полімерази — зворотної транскриптазы (RT — reverse transcriptase). Реакція, що каталізується цим ферментом, приводить до утворення одноланцюгових фрагментів ДНК, використовуваних надалі в ампліфікації за допомогою Taq-полимеразы.
Як було відмічено вище, Taq-полімераза нездатна каталізувати процес зворотньої транскрипції, тобто синтез одноланцюгової ДНК на РНК-матриці. У 1991 році Маєрсом і Гельфандом охарактеризований фермент ДНК-залежної ДНК-полімерази, виділеної з іншого екстремального термофілу Thermus thermophilus (Tth-полиме-раза), який у присутності іонів магнію і хелаторов іонів марганцю дозволяв ферменту каталізувати звичайну ДНК-залежну ДНК-полімеразну реакцію. Цей фермент міг бути використаний для одночасного синтезу комплементарних одноланцюгових фрагментів ДНК і ампліфікації.
Реєстрація результатів. В більшості випадків ампліфікований фрагмент ДНК або кДНК виявляють методом електрофорезу в 1,5-2% гелю агарози у присутності бромистого етидія, який утворює з фрагментами ДНК стійкий комплекс. При опромінюванні гелю ультрафіолетом довжиною хвилі 290-330 нм ампліфіковані фрагменти ДНК виявляються у вигляді смуг, що світяться.
Специфічність смуги визначається її положенням по відношенню до ДНК-маркера і позитивного контролю.
Специфічність ампліфікованого фрагмента також може бути підтверджена рестрикційним аналізом або гібридизацією із специфічним міченим флуоресцентним або радіоактивним зондом.
Інші методи детекції засновані на ідентифікації мічених компонентів реакції. Зокрема, в окремих тест-системах (фірми "Хофманн Ля Рош") використовуються праймери, мічені биотином. В процесі детекції амлікон, мічений биотином, гібридизуєтся із специфічним ДНК-зондом, іммобілізованним на мікропланшеті. Активність ферменту, що входить в комплекс ампликон-биотин-авидин-пероксидаза хріну, виявляють прийомом, використовуваним при стандартному іммуноферментном аналізі. Інтенсивність забарвлення визначають на планшетному фотометрі при 450 нм. Даний підхід дозволяє проводити об'єктивну оцінку результатів реакції у вигляді показників оптичної щільності і, отже, кількісно визначати концентрацію ДНК або РНК в пробі.
Полімеразна ланцюгова реакція — високочутливий специфічний метод. Нажаль, він не виключає можливої контамінації.
Попадання в реакційну пробірку слідів ДНК або кДНК збудника (специфічних продуктів ампліфікації; ДНК-стандарту, використовуваного як позитивний контроль; ДНК або кДНК збудника клінічного зразка) приводить до ампліфікації в процесі реакції специфічного фрагмента ДНК і, як наслідок, до появи псевдопозитивних результатів.
Небезпеку представляють в основному два види контамінації: перехресна — від проби до проби (в процесі обробки клінічних зразків або розбризкування реакційної суміші), що приводить до появи спорадичних псевдопозитивних результатів; і продуктами ампліфікація (ампликоны), яка є також причиною отримання псевдопозитивних результатів. В процесі проведення ПЛР ампликоны накопичуються у великих кількостях і є класичними матрицями для реампліфікації.
Розрізняють і контамінацію слідами ампліконами посуду, автоматичних піпеток і лабораторного устаткування, поверхні лабораторних столів.
На підставі досвіду ПЛР-лабораторий до теперішнього часу сформульовані основні принципи організації діагности, що виключають можливість контамінації і отримання псевдопозитивних результатів.
Необхідно розділити різні стадії проведення аналізу, розміщуючи їх в окремих приміщеннях: для виділення ДНК або РНК; для проведення детекції продуктів ампліфікації.
Клінічні зразки необхідно поміщати тільки в одноразові стерильні пластикові пробірки. Робота повинна проводитися в лабораторному одязі, що змінюється при переході з одного приміщення в інше. Бажано, щоб на кожному етапі проведення реакції працювали інші співробітники.
На різних стадіях аналізу слід мати окремі набори напівавтоматичних піпеток.
Використовувати тільки одноразові матеріали, наконечники для мікропіпеток, пробірки, рукавички і так далі. Бажано застосовувати наконечники з аерозольним фільтром, що оберігає попадання мікрокрапель розчину в піпетку. Після роботи пробірки і наконечники повинні скидатися в дезинфікуючий розчин (1Н соляної кислоти, 10% гипохлорида натрію, 10% хлорною винищити).
Опромінювання робочих поверхонь проводять протягом 1 години до початку і після досвіду (випромінювання до 260 нм).
В даний час успішно застосовують метод ферментативного попередження контамінації. Суть його полягає в тому, що замість одного з 4 дНТФ, а саме замість дТТФ (дезокситимідинтрифосфат) вводиться аналог дУТФ (дезоксиуридинтрифосфат), який включившись в ампліфікон замість дТТФ, робить цей ампліфікон чутливим до ферменту урацил-глікозилази, яка також вводиться в ампліфікациону суміш. Деякі комерційні ПЛР-тест-систеи містять ці компоненти і тому гарантують відсутність псевдопозитивних результатів від контамінації. Подібну систему захисту мають ряд тест-систем, що випускаються зарубіжними фірмами, зокрема фірмою "Хофманн Ля Рош" [1].
3. Переваги ПЛР-діагностики інфекційних захворювань тварин
Метод дозволяє досягти гранично можливої чутливості: від одного до декількох збудників в пробі. Специфічність методу складає 99-100 відсотків. Для ПЛР-аналіза придатний будь-який матеріал, у тому числі і гістологічні препарати. Кількість досліджуваного матеріалу, як правило, складає декілька десятків мікролітів. Висока чутливість методу дозволяє контролювати ефективність лікування, що проводиться. ПЛР успішно використовується при діагностиці важкокультивованих і некультивованих збудників, а також хронічних, латентних і персистентных форм інфекції. Тривалість аналізу не перевищує 5-6 годин.
Але разом з перевагими є певний недолік, який можна охарактеризувати як технологічний. Маються на увазі підвищені вимоги до оснащення лабораторії, якості тест-наборів і строге дотримання регламенту дослідження щоб уникнути отримання помилкових результатів. Вирішення проблеми якості аналізів можливо при відповідній кваліфікації персоналу і обов'язкової сертифікації лабораторії.
Розробка методик і випробування приладів і устаткування — один з етапів великої роботи по впровадженню ПЛР-методів в практику діагностичних лабораторій. У зв'язку із зростаючим інтересом до ПЛР-діагностики впровадження її методів в систему державної ветеринарної служби — справа сьогоднішнього дня. Необхідно відзначити, що перспективними напрямами є визначення антибіотикорезистентності клінічних штамів збудників, можливість кількісного обліку результатів для контролю динаміки інфекційного процесу, правильного вибору тактики лікування і оцінки ефективності вживаних лікарських засобів.
До теперішнього часу ветеринарними фахівцями вже розроблені тест-системи для діагностики методом ПЛР таких захворювань, як туберкульоз, сибірська виразка, лейкоз, чума великої рогатої худоби, сказ, ящур, бруцельоз, кампилобактеріоз, лістеріоз, хламідіоз тварин, класична чума свиней, респіраторно-репродуктивний синдром свиней, парвовірусна інфекція свиней, енцефаломіокардит свиней, сальмонельоз, стафилококкоз, мікоплазмоз, хвороба Марека, реовирусная інфекція, хвороба Гамборо, інфекційний бронхіт птахів, ньюкаслська хвороба; чума м'ясоїдних, вірусний ентерит норок, вірусний гепатит качок та ін. [4].
Діагностика приватної патології методом ПЛР. У даному розділі розглянуті тільки деякі види патології, при яких цей метод грає важливу роль. Слід зазначити, що дана діагностика — один із способів і не може повністю замінити вживаний в даний час комплекс діагностичних досліджень.