3.2.2.1.. Определение антител в реакции агглютинации,
Реакция агглютинации (РА) используется для идентификации возбудителя
болезни с помощью стандартной (референтной) агглютинирующей сыворотки.
Агглютинацией называется склеивание микробов агглютининами сыворотки в
присутствии электролитов, т.е. солевых растворов.
Принцип метода основан на установлении способности сыворотки крови
иммунных рыб склеивать микроорганизмы, вызвавшие этот иммунный ответ.
Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; 0,65%-ный стерильный
раствор натрия хлорида; сыворотка крови обследуемых рыб; водяная баня,
отрегулированная на 60° С; одномиллиардная взвесь суточной культуры
инактивированных микроорганизмов возбудителей болезни рыб, приготовленная
на 0.65%- ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат, отрегулированный
на 26° С; агглютиноскоп; пастеровские пипетки, пробирки, шприцы и
инъекционные иглы для взятия крови - стерильные.
Материал для исследования, ход определения ч учет. результатов.
В штатив размещают ряд из 8 или более пробирок. В первую вносят 0.2 мл
сыворотки, в остальные - такой же объем 0.65%-ного стерильного раствора натрия
хлорида. Во вторую пробирку к разбавителю добавляют 0-2 мл цельной сыворотки
и тщательно перемешивают содержимое пробирки пилотированием. Стандартный
объем (0.2 мл) смеси переносят в следующую (третью) пробирку, тщательно
смешивают с разбавителем и переносят в четвертую, и так далее до предпоследней
пробирки рядя, из которой стандартный объем смеси удаляют. В результате
получают серию разведении, в которой содержание исходной сыворотки (и
соответственно антител) убывает в геометрической прогрессии 1:2, 1:4, 1:8 и т.д.
до 1:64 и более. После внесения 0,2 мл жидкости в очередную пробирку пипетку заменяют на новую.
В пробирки с разведенной сывороткой (кроме первой - контроль сыворотки)
и в последнюю пробирку с физраствором (контроль антигена) вносят по 0.05 мл (1
капля) тест-антигена, тщательно перемешивают до получения равномерной взвеси
и помещают в термостат на 2-3 часа при 26°С. Контролем служат сыворотка и
антиген без сыворотки (первая и последняя пробирки ряда). Штатив с пробирками
вынимают из термостата и проводят предварительную оценку реакции, затем
оставляют при комнатной температуре на 20-24 часа. Окончательную оценку
реакции осуществляют с помощью агглютиноскопа. Учет реакции проводят по
четырехбалльной системе:
"++++" - полная агглютинация (осадок рыхлый в виде зонтика, жидкость над
осадком прозрачная, при встряхивании видны хлопья или зерна различной
величины);
"+++" - полная агглютинация (осадок такой же, надосадочная жидкость менее
прозрачна);
"++" - неполная агглютинация (осадок небольшой, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"+" - следы агглютинации (осадок незначительный, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"-" - отрицательная реакция (осадка нет, взвесь равномерно мутная).
В контроле антигена - осадка нет, взвесь равномерно мутная. Наивысшее
разведение исследуемой сыворотки, в которой происходит агглютинация
добавленных микробных клеток при оценке не менее, чем на два креста, считают
ее титром.
3.2.2.2. Реакция агглютинации латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг
(Зингер, Плотц, 1956).
Принцип метода. Реакция агглютинации мслкодисперсных частиц латекса,
нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (at)
иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ,
применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ
и диагностики возбудителя болезни.
Компоненты и материалы. at - 5%-ный раствор растворимого антигена (в
качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей
болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная
суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81
мкм на 0.65% растворе nacl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель.
Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50
мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет.
воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора naoh и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида
натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с
помощью 1 н. раствора naoh, добавляют 10 г nacl. Материалы:
пипетки, пробирки, колбы и др.
Техника постановки реакции. Дм сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл
10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора
АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и
выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с
приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки
исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280-
1:2560.
Капельная реакция латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2
капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1
капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В
контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями
инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и
выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в
течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.
Пробирочная реакция латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок
приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и
добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия
латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки
встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при
1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат
реакции.
Учет и оценка результатов реакции производятся по образованию зерен
латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов
целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной
системе.
4. Определение напряженности иммунитета
Под напряженностью иммунитета следует понимать способность организма
рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам
метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета
отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной
системы рыб на уровне целостного организма.
Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или
устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные
болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами.
Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при
определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и
неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая
токсические) факторов на выживаемость рыб.
4.1. Методика определения напряженности иммунитета (с ис-
пользованием a.hydrophila)
4.1.1. Принцип метода основан на экспериментальном заражении рыб
вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого
вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности
ld5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности
естественного иммунитета.
4.1.2. Оборудование и реактивы: аквариумы, пробирки, шприцы, рыба,
суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни
рыб.
4.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов.
Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель
навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С)
пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в
карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1
л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно
одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий a. hydrophila,
приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125;
0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в
течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости
устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с
характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими
изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (ld5o),
проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973).
Расчитанной дозой ld50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых
рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся
при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения
болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов
осуществляют так же, как и при отработке дозы ld5o. Напряженность иммунитета
определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с
контролем.
По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в
аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%-
ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть,
а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с
больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах,
земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию
воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5
мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют
только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа
прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их
без воды на срок не менее месяца. С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические указания по определению уровней естественной резистентности организма рыб (к инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 13.07.87 №432-3.