Материалы для исследования, ход определения и учет результатов.
Из крови рыб выделяют лимфоциты путем центрифугирования в градиенте
фикол-верографина. В силиконизированную пробирку, смоченную раствором
гепарина (или цитрата натрия), набирают 1 -2 мл крови рыб, разводят 1:1
раствором Хснкса; на дно сухой пробирки аккуратно наливают 1,5-2 мл градиента
плотности; наклонив пробирку под углом 45°; пробирки цснтри4)угируют при i500
об/мин в течение 40 минут; после центрифугирования пипеткой собирают кольцо
лимфоцитов, находящееся между слоями плазмы и градиентом плотности; клетки
дважды отмывают раствором Хенкса при 1500 об/мин в течение 10 минут; под-
считывают концентрацию лимфоцитов в камере Горяева и доводят раствором
Хенкса (или средой 199) до 2 млн. кл/мл. - трижды отмытые эритроциты барана
разводят средой 199 до 0,5% концентрации. В силиконизированную пробирку
объемом 1-2 мл вносят 0,1 мл 0,5% раствора эритроцитов барана, к эритроцитам
барана добавляют 0,1 мл суспензии лимфоцитов (2 млн. кл/мл), смесь инкубируют
5 мин при 26° С, после инкубации смесь центрифугируют в течение 5 мин при 750
об/мин и инкубируют при 26° С в течение 1 часа. По истечении инкубации клетки
фиксируют глутаровым альдегидом (0,05 мл 3% раствора) и после отмы-вания от
глутарового альдегида делают мазки. Мазки фиксируют в метаноле. красят метил-
грюн-пиронином по Брашс и микроскопируют. Число Н-розеткообразующих
клеток в процентах вычисляют в результате подсчета 200-300 лимфоцитов в
препарате. За розеткообразуюшую клетку (РОК) принимают лимфоцит,
присоединивший нс менее 3 эритроцитов барана. Абсолютные цифры Е-
розеткообразующих клеток в 1 мкл выводят на основании количества лимфоцитов
в 1 мкл крови. Лимфоциты можно выделить из суспензии клеток селезенки,
лимфоидной ткани про-и мезонефроса и тимуса.
• Определение Т-, В-, Д-И 0-лимфоцитов (по Мэндес, 1973).
Принцип метода. При смешивании лимфоидных клеток рыб с эритроцитами
барана (ЭБ), частичками зимозана, сенсибилизированными макроглобулиновыми
антителами с комплементом, происходит их избирательная адсорбция
лимфоидными клетками: на Т-лимфоцитах адсорбируются эритроциты барана, на
В-лимфоцитах - частицы зимозана, на Д-лимфоцитах - частицы зимозана и
эритроциты барана; 0-лимфоциты остаются свободными от эритроцитов и
частичек зимозана. Данный метод применяется для идентификации
популяционной структуры лимфоцитов.
Компоненты, материалы и оборудование. Лф - суспензия лим-({юцитов рыб,
концентрацией 2 млн. клеток/мл, в среде 199 (или Хснкса). Способ получения Лф
(см. выше). ЭБ - 0,5%-ная взвесь эритроцитов барана - индикаторы для Т-
лимфоцитов; частицы зимозана конъюгирован-ньге с комплементом (индикаторы
для В-лимфоцитов). Разбавители: физ-раствор, среда 199. Материалы и
оборудование: гепарин, хлористый аммоний, 0,2%-ный раствор трипановой сини,
глутаральдсгид,разделяющий раствор с плотностью 1,077 г/мл,
силиконизированныс цснтрифужные и другие пробирки, пипетки, счетные камеры
Горяева или Бюркера, холодильник, фазовоконтрастный микроскоп.
Техника постановки реакции. В силиконизированную пробирку приливают
по 0,1 мл взвеси лимфоцитов, 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана и частички
зимозана с комплементом. Смесь клеток инкубируют 5 мин при 26°С,
центрифугируют 5 мин при 800-1000 об/мин и вновь инкубируют при 12° С - 60
мин. Осадок осторожно ресуспендируют, наносят каплю взвеси клеток на
предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Из капли
взвеси можно готовить мазки на предметных стеклах и покрасить их но
Романовскому-Гимза.
Учет и оценка результатов реакции осуществляются одновременно и
параллельно в световом и фазово-контрастном микроскопах. Просматривают 200
лимфоцитов и определяют процент РОК. Т-лимфоцит образует розетку из 3 и
более ЭБ, В-лимфоцит - из 3 и более частиц зимозана;
Д-лимфоцит образует смешанную розетку - 2 ЭБ + 2 и более частиц зимозана; 0-
лимфоцит розеток не образует.
3.2. Гуморальные факторы
3.2.1. Имуноглобулины. Они являются биохимической основой
специфического гуморального иммунитета, выполняют функцию специфических
антител к конкретным антигенам, синтезируются плазматическими клетками (В-
лимфоцитами) и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная их
часть относится к гамма - глобулиновой фракции сыворотки крови.
Методы определения содержания в организме рыб иммуноглобули-нов
основаны на оценке содержания гамма-глобулинов в сыворотке крови или других
биологических жидкостях. Простыми и доступными приемами исследования
гамма-глобулинов в сыворотке крови и других жидкостях являются методы
электрофореза, хроматографии на анио-нообменниках, осаждения насыщенными
растворами фосфатов или сульфатов. Существуют также иммунологические
методы определения содержания гамма-глобулинов у рыб с помощью
антисывороток.
Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови рыб по гамма-
глобулину методом осаждения.
Принцип метода. При взаимодействия с насыщенными растворами
фосфатов, определенной концентрации гамма - глобулины осаждаются. изменяя
тем самым оптическую плотность исследуемого образца. Определение
производится параллельно с другими фракциями сыворотки крови (альбуминами,
альфа и бета-глобулинами), по изменению оптической плотности (ОП) на ФЭКе.
Оборудование и реактивы. ФЭК, химические пробирки, пипетки на !. 2, 5, 10
мл, бюретка на 100 мл, мерные колбы на 100 и 500 мл, холодильник, сыворотка
крови, фосфатные растворы (основной и рабочий), штативы для пробирок.
Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Вначале
готовят основной фосфатный раствор: 335 г гидроокиси натрия растворяют в 400
мл дистиллированной воды, добавляют 226,8 г фосфорнокислого калия
однозамещснното. После растворения охлаждают до комнатной температуры и
добавляют дистиллированную воду до объема 500 мл, затем готовят рабочие
фосфатные растворы для осаждения каждой (фракции белков. Берут 4 мерных
колбы на 100 мл, которые нумеруют соответственно n 1, 2, 3 и 4. В каждую колбу
вносят строго определенное количество основного фос4)атного раствора: 92,4 мл -
n 1, 74,9 мл - n 2. 58,8 мл - n 3, 48,7 мл - n 4 и до метки 100 мл доливают
дистиллированную воду. После этого рабочие растворы в колбах тщательно разме-
шивают путем встряхивания (при хранении добавляют i каплю хлороформа на 100
мл раствора). После приготовления (фосфатных растворов приступают к
определению белковых фракций в исследуемых образцах. На каждую пробу
сыворотки крови берут 6 пробирок и нумеруют: 0. 1, 2, 3, 4, 5. В пробирку под
цифрой 0 вносятся 10 мл дистиллированной воды, в пробирки под номерами 1, 2, 3
и 4 - по 5 мл соответствующих этим цифрам рабочих фосфатных растворов. В
пробирку n5 вносят 0.5 мл исследуемой сыворотки крови, 0.75 мл
дистиллированной воды и 3.75 мл основного фосфатного раствора, пробирку
закрывают пробкой и перемешивают путем перевертывания ее 5-6 раз, после чего
из этой пробирки переносят по 0.5 мл смеси в пробирки n i, 2, 3, 4 и 1 мл в
пробирку под номером 0 (контроль). Содержимое пробирок тщательно и осторожно перемешивают, избегая образования пены и пузырьков воздуха и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. По истечении указанного срока осуществляют измерение ОГГ растворов в пробирках n 1, 2, 3, 4 против контроля (n 0) на ФЭКс при красном
светофильтре в кювете с длинной оптического пути 1 см. Определение оптической плотности проводится сначала в пробирке n4, затем в пробирках n 3, 2 и 1.
Расчет результатов производится по схеме: ОП пробирки n1 - ОП пробирки n2 = ОП альбуминов; ОП пробирки n2 - ОП пробирки n3 = ОП альфа-глобулинов;
ОП пробирки n3 - ОП пробирки n4 = ОП бета-глобулинов;
ОП пробирки n4 = ОПгамма-глобулинов.
Принимая сумму ОП альбуминов и всех глобулиновых 4>ракций за 100%
(ОП пробирки n1), вычисляют долю содержания каждой фракции в процентах.
Процентное содержание гамма-глобулинов определяют по (формуле:
Относительное содержание гамма-глобулина, % = ОПкк х 1 ()(). где:
ЮП
ongg - гамма-глобулина (ОП - пробирки n 4), ?0n - сумма ОП всех белковых
фракций (ОП пробирки n 1), 100 - коэффициент перевода содержания гамма-
глобулина в %. Зная концентрацию общего белка в единице объема можно
произвести перерасчет в абсолютные величины. Ошибка метода составляет + 4%.
3.2.2. Антитела
Антитела представляют собой сывороточные белки, синтезируемые В-
лимфоцитами при попадании в организм антигена или чужеродных тел и
вступающие с ними во взаимодействие. Главными свойствами антител являются
специфичность и гетерогенность. Специфичность антител определяется
антигеном, вызывающим их синтез. Рыбы, как и высшие позвоночные,
синтезируют разнообразные по структуре и функции антитела: агглютинины,
преципитины, антитоксины, комплементсвязывающие и вируснейтрализующие
антитела, гемолизины, полные и неполные. Антитела по происхождению
подразделяются на естественные и индуцируемые (образующиеся после
парентерального и энтерального введения антигена). Они являются одной из
информационных структур иммунной системы, выполняющих функцию
иммунологической памяти об антигене. Благодаря высокой специфичности
антитела используются при определении природы антигенов, вызывающих их
синтез, напряженности активно приобретенного иммунитета, характера течения
процесса иммуногенеза и характера влияния благоприятных и неблагоприятных
факторов на иммунную систему рыб. Существуют многочисленные методы определения содержания антител в организме рыб: серологические, иммуноэлектрофоретические, радиоиммунные, иммуноферментные, иммунодиффузныс, лазерные.
Наиболее простыми и общепринятыми методами определения антител в
организме рыб являются: реакция агглютинации, реакция агглютинации дате кс-
антигена (или антител).